మయోసిన్ హెవీ చైన్‌కు ఆవల మానవ అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌ల భిన్నత్వం

nature.com ను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌లో CSS మద్దతు పరిమితంగా ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, తాజా బ్రౌజర్ వెర్షన్‌ను ఉపయోగించమని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను నిలిపివేయమని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. అదనంగా, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, ఈ సైట్‌లో స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ ఉండవు.
అస్థిపంజర కండరం అనేది ప్రధానంగా మైయోఫైబ్రిల్స్‌తో కూడిన ఒక వైవిధ్యభరితమైన కణజాలం. మానవులలో వీటిని సాధారణంగా మూడు రకాలుగా వర్గీకరిస్తారు: ఒకటి "నెమ్మది" (టైప్ 1) మరియు రెండు "వేగవంతమైనవి" (టైప్ 2A మరియు 2X). అయితే, సాంప్రదాయ మైయోఫైబ్రిల్ రకాల మధ్య మరియు వాటి లోపల ఉండే వైవిధ్యం గురించి ఇప్పటికీ సరిగా అర్థం కాలేదు. మేము మానవ వాస్టస్ లేటరాలిస్ నుండి సేకరించిన 1050 మరియు 1038 వ్యక్తిగత మైయోఫైబ్రిల్స్‌కు వరుసగా ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటియోమిక్ పద్ధతులను వర్తింపజేశాము. ప్రోటియోమిక్ అధ్యయనంలో పురుషులను, మరియు ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ అధ్యయనంలో 10 మంది పురుషులు మరియు 2 మంది మహిళలను చేర్చాము. మైయోసిన్ హెవీ చైన్ ఐసోఫార్మ్‌లతో పాటు, జీవక్రియ ప్రోటీన్లు, రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లు మరియు సెల్యులార్ జంక్షనల్ ప్రోటీన్లను కూడా మైయోఫైబ్రిల్‌ల మధ్య బహుముఖ వైవిధ్యానికి మూలాలుగా మేము గుర్తించాము. అంతేకాకుండా, నెమ్మది మరియు వేగవంతమైన ఫైబర్‌ల సమూహాలను గుర్తించినప్పటికీ, టైప్ 2X ఫైబర్‌లు బాహ్యరూపంలో ఇతర ఫాస్ట్-ట్విచ్ ఫైబర్‌ల నుండి వేరు చేయలేనివిగా ఉన్నాయని మా డేటా సూచిస్తుంది. అంతేకాకుండా, నెమలైన్ మయోపతీలలో మయోఫైబర్ ఫినోటైప్‌ను వివరించడానికి మయోసిన్ హెవీ చైన్ ఆధారిత వర్గీకరణ సరిపోదు. మొత్తంమీద, మా డేటా బహుముఖ మయోఫైబర్ భిన్నత్వాన్ని సూచిస్తుంది, దీనిలోని వైవిధ్య మూలాలు మయోసిన్ హెవీ చైన్ ఐసోఫామ్‌లకు మించి విస్తరించి ఉన్నాయి.
కణ వైవిధ్యం అనేది అన్ని జీవ వ్యవస్థలలో అంతర్లీనంగా ఉండే ఒక లక్షణం, ఇది కణజాలాలు మరియు కణాల యొక్క విభిన్న అవసరాలను తీర్చడానికి కణాలు ప్రత్యేకతను సంతరించుకోవడానికి అనుమతిస్తుంది.1 అస్థిపంజర కండర ఫైబర్ వైవిధ్యంపై సాంప్రదాయ దృక్పథం ప్రకారం, మోటార్ న్యూరాన్లు ఒక మోటార్ యూనిట్‌లోని ఫైబర్ రకాన్ని నిర్వచిస్తాయి, మరియు ఆ ఫైబర్ రకం (అంటే, మానవులలో టైప్ 1, టైప్ 2A, మరియు టైప్ 2X) మైయోసిన్ హెవీ చైన్ (MYH) ఐసోఫామ్‌ల లక్షణాల ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది.2 ఇది ప్రారంభంలో వాటి pH ATPase అస్థిరతపై,3,4 మరియు తరువాత వాటి MYH యొక్క అణు వ్యక్తీకరణపై ఆధారపడింది.5 అయితే, విభిన్న నిష్పత్తులలో బహుళ MYHలను సహ-వ్యక్తీకరించే "మిశ్రమ" ఫైబర్‌లను గుర్తించి, తదనంతరం అంగీకరించడంతో, అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లు విభిన్న ఫైబర్ రకాలుగా కాకుండా ఒక అవిచ్ఛిన్న శ్రేణిగా ఎక్కువగా పరిగణించబడుతున్నాయి.6 అయినప్పటికీ, ఈ రంగం ఇప్పటికీ మైయోఫైబర్ వర్గీకరణకు ప్రాథమిక వర్గీకరణగా MYHపై ఎక్కువగా ఆధారపడి ఉంది. ఈ దృక్పథం, ప్రారంభ ఎలుకల అధ్యయనాల పరిమితులు మరియు గణనీయమైన పక్షపాతాలచే ప్రభావితమై ఉండవచ్చు, ఎందుకంటే వాటి MYH వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌లు మరియు ఫైబర్ రకాల పరిధి మానవులలోని వాటికి భిన్నంగా ఉంటాయి.2 విభిన్న మానవ అస్థిపంజర కండరాలు వేర్వేరు లక్షణాలను ప్రదర్శిస్తాయనే వాస్తవం వల్ల ఈ పరిస్థితి మరింత క్లిష్టంగా మారుతుంది. విభిన్న రకాల ఫైబర్ రకాలు.7 వాస్టస్ లాటరాలిస్ అనేది ఒక మిశ్రమ కండరం, ఇది మధ్యస్థ (మరియు అందువల్ల ప్రాతినిధ్య) MYH వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌ను కలిగి ఉంటుంది.7 అంతేకాకుండా, దీని నమూనా సేకరణలో సౌలభ్యం దీనిని మానవులలో ఉత్తమంగా అధ్యయనం చేయబడిన కండరంగా చేస్తుంది.
అందువల్ల, శక్తివంతమైన “ఓమిక్స్” సాధనాలను ఉపయోగించి అస్థిపంజర కండర తంతువుల వైవిధ్యాన్ని నిష్పక్షపాతంగా పరిశోధించడం చాలా కీలకమైనది, కానీ అస్థిపంజర కండర తంతువుల బహుకేంద్రక స్వభావం కారణంగా ఇది సవాలుతో కూడుకున్నది కూడా. అయితే, ఇటీవలి సంవత్సరాలలో వివిధ సాంకేతిక పురోగతుల కారణంగా ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్8,9 మరియు ప్రోటియోమిక్స్10 సాంకేతికతలు సున్నితత్వంలో విప్లవాత్మక మార్పును సాధించాయి, దీనివల్ల అస్థిపంజర కండరాలను సింగిల్-ఫైబర్ రిజల్యూషన్‌తో విశ్లేషించడం సాధ్యమవుతోంది. ఫలితంగా, సింగిల్-ఫైబర్ వైవిధ్యాన్ని మరియు క్షీణత ప్రేరకాలు మరియు వృద్ధాప్యానికి వాటి ప్రతిస్పందనను వర్గీకరించడంలో గణనీయమైన పురోగతి సాధించబడింది11,12,13,14,15,16,17,18. ముఖ్యంగా, ఈ సాంకేతిక పురోగతులకు వైద్యపరమైన అనువర్తనాలు ఉన్నాయి, ఇవి వ్యాధి సంబంధిత అస్తవ్యవస్థను మరింత వివరంగా మరియు కచ్చితంగా వర్గీకరించడానికి వీలు కల్పిస్తాయి. ఉదాహరణకు, అత్యంత సాధారణంగా సంక్రమించే కండరాల వ్యాధులలో ఒకటైన నెమలైన్ మయోపతి (MIM 605355 మరియు MIM 161800) యొక్క పాథోఫిజియాలజీ సంక్లిష్టంగా మరియు గందరగోళంగా ఉంటుంది.19,20 అందువల్ల, అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌ల యొక్క అస్తవ్యస్తతను మరింత మెరుగ్గా వర్గీకరించడం ఈ వ్యాధిపై మన అవగాహనలో గణనీయమైన పురోగతికి దారితీయవచ్చు.
మానవ బయాప్సీ నమూనాల నుండి చేతితో వేరుచేయబడిన ఏక కండర తంతువుల ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటియోమిక్ విశ్లేషణ కోసం మేము పద్ధతులను అభివృద్ధి చేసి, వాటిని వేలాది తంతువులకు వర్తింపజేశాము. ఇది మానవ కండర తంతువుల సెల్యులార్ వైవిధ్యతను పరిశోధించడానికి మాకు వీలు కల్పించింది. ఈ పనిలో భాగంగా, మేము కండర తంతువుల ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటియోమిక్ ఫినోటైపింగ్ యొక్క శక్తిని ప్రదర్శించాము మరియు జీవక్రియ, రైబోసోమల్, మరియు సెల్యులార్ జంక్షనల్ ప్రోటీన్‌లను తంతువుల మధ్య వైవిధ్యానికి ముఖ్యమైన మూలాలుగా గుర్తించాము. అంతేకాకుండా, ఈ ప్రోటియోమిక్ వర్క్‌ఫ్లోను ఉపయోగించి, మేము ఏక కండర తంతువులలో నెమటోడ్ మయోపతీ యొక్క వైద్యపరమైన ప్రాముఖ్యతను వర్గీకరించాము. ఇది MYH ఆధారంగా తంతువు రకంతో సంబంధం లేకుండా ఆక్సీకరణేతర తంతువుల వైపు సమన్వయంతో కూడిన మార్పును వెల్లడించింది.
మానవ అస్థిపంజర కండర తంతువుల భిన్నత్వాన్ని పరిశోధించడానికి, మేము ఒకే అస్థిపంజర కండర తంతువు యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ మరియు ప్రోటియోమ్ విశ్లేషణను సాధ్యం చేసే రెండు వర్క్‌ఫ్లోలను అభివృద్ధి చేశాము (పటం 1A మరియు అనుబంధ పటం 1A). నమూనా నిల్వ మరియు RNA, ప్రోటీన్ సమగ్రతను కాపాడటం నుండి ప్రతి విధానానికి థ్రూపుట్‌ను ఆప్టిమైజ్ చేయడం వరకు, మేము అనేక పద్ధతిపరమైన దశలను అభివృద్ధి చేసి, ఆప్టిమైజ్ చేశాము. ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ విశ్లేషణ కోసం, రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ యొక్క ప్రారంభ దశలో నమూనా-నిర్దిష్ట మాలిక్యులర్ బార్‌కోడ్‌లను చేర్చడం ద్వారా ఇది సాధించబడింది, ఇది సమర్థవంతమైన తదుపరి ప్రాసెసింగ్ కోసం 96 తంతువులను పూల్ చేయడానికి అనుమతించింది. సాంప్రదాయ సింగిల్-సెల్ విధానాలతో పోలిస్తే లోతైన సీక్వెన్సింగ్ (ప్రతి తంతువుకు ±1 మిలియన్ రీడ్స్) ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ డేటాను మరింత సుసంపన్నం చేసింది. 21 ప్రోటియోమిక్స్ కోసం, అధిక థ్రూపుట్‌ను కొనసాగిస్తూ ప్రోటియోమ్ లోతును ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి, మేము టిమ్స్‌టాఫ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌పై DIA-PASEF డేటా సేకరణతో కలిపి ఒక చిన్న క్రోమాటోగ్రాఫిక్ గ్రేడియంట్ (21 నిమిషాలు) ఉపయోగించాము. 22,23 ఆరోగ్యకరమైన అస్థిపంజర కండర తంతువుల భిన్నత్వాన్ని పరిశోధించడానికి, మేము 14 మంది ఆరోగ్యకరమైన వయోజన దాతల నుండి 1,050 వ్యక్తిగత తంతువుల ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్‌లను మరియు 5 మంది ఆరోగ్యకరమైన వయోజన దాతల నుండి 1,038 తంతువుల ప్రోటియోమ్‌లను వర్గీకరించాము (అనుబంధ పట్టిక 1). ఈ పత్రంలో, ఈ డేటాసెట్‌లను వరుసగా 1,000-తంతువుల ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్‌లు మరియు ప్రోటియోమ్‌లుగా సూచిస్తారు. మా విధానం 1,000-తంతువుల ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటియోమిక్ విశ్లేషణలలో మొత్తం 27,237 ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లను మరియు 2,983 ప్రోటీన్‌లను గుర్తించింది (చిత్రం 1A, అనుబంధ డేటాసెట్‌లు 1–2). ప్రతి తంతువుకు 1,000 కంటే ఎక్కువ గుర్తించబడిన జన్యువులు మరియు 50% చెల్లుబాటు అయ్యే విలువల కోసం ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటియోమిక్ డేటాసెట్‌లను ఫిల్టర్ చేసిన తర్వాత, వరుసగా ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ మరియు ప్రోటియోమ్‌లలో 925 మరియు 974 తంతువుల కోసం తదుపరి బయోఇన్ఫర్మాటిక్స్ విశ్లేషణలు నిర్వహించబడ్డాయి. ఫిల్టరింగ్ తర్వాత, ప్రతి ఫైబర్‌కు సగటున 4257 ± 1557 జన్యువులు మరియు 2015 ± 234 ప్రోటీన్లు (సగటు ± ప్రామాణిక విచలనం) గుర్తించబడ్డాయి, వ్యక్తుల మధ్య వైవిధ్యం పరిమితంగా ఉంది (అనుబంధ చిత్రాలు 1B–C, అనుబంధ డేటాసెట్‌లు 3–4). అయితే, పాల్గొన్నవారిలో వ్యక్తిగత వైవిధ్యం మరింత స్పష్టంగా కనిపించింది, బహుశా వివిధ పొడవులు మరియు అడ్డుకోత వైశాల్యాలు గల ఫైబర్‌ల మధ్య RNA/ప్రోటీన్ దిగుబడిలో తేడాల కారణంగా ఇది జరిగి ఉండవచ్చు. చాలా ప్రోటీన్‌లకు (>2000), వైవిధ్య గుణకం 20% కంటే తక్కువగా ఉంది (అనుబంధ చిత్రం 1D). కండరాల సంకోచానికి ముఖ్యమైన, అధికంగా వ్యక్తమయ్యే సిగ్నేచర్‌లు (ఉదాహరణకు, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) గల ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌ల యొక్క విస్తృత డైనమిక్ పరిధిని సంగ్రహించడానికి ఈ రెండు పద్ధతులు అనుమతించాయి (అనుబంధ చిత్రాలు 1E–F). గుర్తించబడిన లక్షణాలలో చాలా వరకు ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటియోమిక్ డేటాసెట్‌ల మధ్య ఉమ్మడిగా ఉన్నాయి (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 1G), మరియు ఈ లక్షణాల సగటు UMI/LFQ తీవ్రతలు సహేతుకంగా బాగా పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి (r = 0.52) (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 1H).
ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు ప్రోటియోమిక్స్ వర్క్‌ఫ్లో (BioRender.comతో సృష్టించబడింది). BD MYH7, MYH2, మరియు MYH1 కొరకు డైనమిక్ రేంజ్ కర్వ్‌లు, మరియు ఫైబర్ రకం కేటాయింపు కొరకు లెక్కించబడిన థ్రెషోల్డ్‌లు. E, F ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు ప్రోటియోమిక్స్ డేటాసెట్‌లలోని ఫైబర్‌ల అంతటా MYH వ్యక్తీకరణ యొక్క పంపిణీ. G, H MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకం ప్రకారం రంగులు వేయబడిన ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు ప్రోటియోమిక్స్ కొరకు యూనిఫార్మ్ డైవర్సిటీ అప్రాక్సిమేషన్ అండ్ ప్రొజెక్షన్ (UMAP) ప్లాట్‌లు. I, J ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు ప్రోటియోమిక్స్ డేటాసెట్‌లలో MYH7, MYH2, మరియు MYH1 వ్యక్తీకరణను చూపే ఫీచర్ ప్లాట్‌లు.
ఓమిక్స్ డేటాసెట్‌లలో MYH వ్యక్తీకరణ యొక్క అధిక సున్నితత్వం మరియు డైనమిక్ పరిధిని సద్వినియోగం చేసుకునే ఒక ఆప్టిమైజ్డ్ విధానాన్ని ఉపయోగించి, మేము ప్రారంభంలో ప్రతి ఫైబర్‌కు MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకాన్ని కేటాయించడానికి ప్రయత్నించాము. మునుపటి అధ్యయనాలు వివిధ MYHల వ్యక్తీకరణ యొక్క స్థిర శాతం ఆధారంగా ఫైబర్‌లను స్వచ్ఛమైన టైప్ 1, టైప్ 2A, టైప్ 2X, లేదా మిశ్రమంగా లేబుల్ చేయడానికి ఏకపక్ష థ్రెషోల్డ్‌లను ఉపయోగించాయి¹¹,¹⁴,²⁴. మేము ఒక విభిన్నమైన విధానాన్ని ఉపయోగించాము, దీనిలో ప్రతి ఫైబర్ యొక్క వ్యక్తీకరణను, ఫైబర్‌లను టైప్ చేయడానికి మేము ఉపయోగించిన MYHల ద్వారా ర్యాంక్ చేయబడింది: అవి వరుసగా టైప్ 1, టైప్ 2A, మరియు టైప్ 2X ఫైబర్‌లకు అనుగుణంగా ఉండే MYH7, MYH2, మరియు MYH1. ఆ తర్వాత మేము ప్రతి ఫలిత వక్రరేఖ యొక్క దిగువ ఇన్ఫ్లెక్షన్ పాయింట్‌ను గణితశాస్త్రపరంగా లెక్కించి, ప్రతి MYHకు ఫైబర్‌లను పాజిటివ్ (థ్రెషోల్డ్ పైన) లేదా నెగటివ్ (థ్రెషోల్డ్ క్రింద)గా కేటాయించడానికి దానిని థ్రెషోల్డ్‌గా ఉపయోగించాము (చిత్రం 1B–D). ఈ డేటా, ప్రోటీన్ స్థాయితో పోలిస్తే RNA స్థాయిలో MYH7 (పటం 1B) మరియు MYH2 (పటం 1C) మరింత విభిన్నమైన ఆన్/ఆఫ్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ ప్రొఫైల్‌లను కలిగి ఉన్నాయని చూపిస్తుంది. నిజానికి, ప్రోటీన్ స్థాయిలో, చాలా తక్కువ ఫైబర్‌లు MYH7ను వ్యక్తీకరించలేదు, మరియు ఏ ఫైబర్‌లోనూ 100% MYH2 ఎక్స్‌ప్రెషన్ లేదు. ఆ తర్వాత, ప్రతి డేటాసెట్‌లోని అన్ని ఫైబర్‌లకు MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకాలను కేటాయించడానికి మేము ముందుగా నిర్ణయించిన ఎక్స్‌ప్రెషన్ థ్రెషోల్డ్‌లను ఉపయోగించాము. ఉదాహరణకు, MYH7+/MYH2-/MYH1- ఫైబర్‌లను టైప్ 1కి కేటాయించగా, MYH7-/MYH2+/MYH1+ ఫైబర్‌లను మిశ్రమ టైప్ 2A/2Xకి కేటాయించాము (పూర్తి వివరణ కోసం అనుబంధ పట్టిక 2 చూడండి). అన్ని ఫైబర్‌లను కలిపి చూసినప్పుడు, RNA (పటం 1E) మరియు ప్రోటీన్ (పటం 1F) స్థాయిలలో MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకాల పంపిణీ ఆశ్చర్యకరంగా ఒకేలా ఉండటాన్ని మేము గమనించాము, అయితే ఊహించిన విధంగానే, MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకాల సాపేక్ష కూర్పు వ్యక్తులను బట్టి మారుతూ ఉంది (అనుబంధ పటం 2A). చాలా ఫైబర్‌లు స్వచ్ఛమైన టైప్ 1 (34–35%) లేదా టైప్ 2A (36–38%) గా వర్గీకరించబడ్డాయి, అయినప్పటికీ గణనీయమైన సంఖ్యలో మిశ్రమ టైప్ 2A/2X ఫైబర్‌లు కూడా కనుగొనబడ్డాయి (16–19%). ఒక ముఖ్యమైన తేడా ఏమిటంటే, స్వచ్ఛమైన టైప్ 2X ఫైబర్‌లను కేవలం RNA స్థాయిలో మాత్రమే గుర్తించగలిగారు, కానీ ప్రోటీన్ స్థాయిలో కాదు. ఇది వేగవంతమైన MYH వ్యక్తీకరణ కనీసం పాక్షికంగానైనా ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ అనంతరంగా నియంత్రించబడుతుందని సూచిస్తుంది.
మేము యాంటీబాడీ-ఆధారిత డాట్ బ్లాటింగ్ ఉపయోగించి మా ప్రోటియోమిక్స్-ఆధారిత MYH ఫైబర్ టైపింగ్ పద్ధతిని ధృవీకరించాము, మరియు స్వచ్ఛమైన టైప్ 1 మరియు టైప్ 2A ఫైబర్‌లను గుర్తించడంలో రెండు పద్ధతులు 100% ఏకీభావం సాధించాయి (అనుబంధ చిత్రం 2B చూడండి). అయితే, ప్రోటియోమిక్స్-ఆధారిత విధానం మరింత సున్నితమైనది, మిశ్రమ ఫైబర్‌లను గుర్తించడంలో మరింత సమర్థవంతమైనది, మరియు ప్రతి ఫైబర్‌లో ప్రతి MYH జన్యువు యొక్క నిష్పత్తిని లెక్కించడంలో కూడా సమర్థవంతమైనది. అస్థిపంజర కండర ఫైబర్ రకాలను వర్గీకరించడానికి ఒక నిష్పాక్షికమైన, అత్యంత సున్నితమైన ఓమిక్స్-ఆధారిత విధానాన్ని ఉపయోగించడం యొక్క ప్రభావాన్ని ఈ డేటా ప్రదర్శిస్తుంది.
తరువాత, మేము ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు ప్రోటియోమిక్స్ అందించిన సంయుక్త సమాచారాన్ని ఉపయోగించి, వాటి పూర్తి ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ లేదా ప్రోటియోమ్ ఆధారంగా మయోఫైబర్‌లను నిష్పక్షపాతంగా వర్గీకరించాము. డైమెన్షనాలిటీని ఆరు ప్రధాన కాంపోనెంట్‌లకు (సప్లిమెంటరీ చిత్రాలు 3A–B) తగ్గించడానికి యూనిఫార్మ్ మానిఫోల్డ్ అప్రాక్సిమేషన్ అండ్ ప్రొజెక్షన్ (UMAP) పద్ధతిని ఉపయోగించి, మేము ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ (చిత్రం 1G) మరియు ప్రోటియోమ్ (చిత్రం 1H) లలో మయోఫైబర్ వైవిధ్యతను దృశ్యమానం చేయగలిగాము. ముఖ్యంగా, ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ లేదా ప్రోటియోమిక్స్ డేటాసెట్‌లలో దేనిలోనూ మయోఫైబర్‌లు పాల్గొనేవారి (సప్లిమెంటరీ చిత్రాలు 3C–D) లేదా పరీక్షా రోజుల (సప్లిమెంటరీ చిత్రం 3E) వారీగా సమూహాలుగా ఏర్పడలేదు, ఇది అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లలో వ్యక్తుల మధ్య వైవిధ్యత కంటే ఒకే వ్యక్తిలో వైవిధ్యత ఎక్కువగా ఉందని సూచిస్తుంది. UMAP ప్లాట్‌లో, "వేగవంతమైన" మరియు "నెమ్మదైన" మయోఫైబర్‌లను సూచించే రెండు విభిన్న సమూహాలు ఉద్భవించాయి (చిత్రాలు 1G–H). MYH7+ (నెమ్మదిగా ఉండే) కండర తంతువులు UMAP1 యొక్క ధనాత్మక ధ్రువం వద్ద సమూహంగా ఏర్పడ్డాయి, అయితే MYH2+ మరియు MYH1+ (వేగంగా ఉండే) కండర తంతువులు UMAP1 యొక్క రుణాత్మక ధ్రువం వద్ద సమూహంగా ఏర్పడ్డాయి (పటాలు 1I–J). అయినప్పటికీ, MYH వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా వేగంగా సంకోచించే తంతువుల రకాల (అంటే, టైప్ 2A, టైప్ 2X, లేదా మిశ్రమ 2A/2X) మధ్య ఎటువంటి వ్యత్యాసం చూపబడలేదు. ఇది, మొత్తం ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ లేదా ప్రోటియోమ్‌ను పరిగణనలోకి తీసుకున్నప్పుడు, MYH1 (పటం 1I–J) లేదా ACTN3 లేదా MYLK2 (అనుబంధ పటాలు 4A–B) వంటి ఇతర సాంప్రదాయ 2X కండర తంతువుల మార్కర్ల వ్యక్తీకరణ వివిధ కండర తంతువుల రకాల మధ్య భేదాన్ని చూపదని సూచిస్తుంది. అంతేకాకుండా, MYH2 మరియు MYH7తో పోలిస్తే, కొన్ని ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు లేదా ప్రోటీన్‌లు మాత్రమే MYH1తో ధనాత్మకంగా సహసంబంధం కలిగి ఉన్నాయి (అనుబంధ పటాలు 4C–H). ఇది, MYH1 సమృద్ధి కండర తంతువుల ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్/ప్రోటియోమ్‌ను పూర్తిగా ప్రతిబింబించదని సూచిస్తుంది. UMAP స్థాయిలో మూడు MYH ఐసోఫామ్‌ల మిశ్రమ వ్యక్తీకరణను అంచనా వేసినప్పుడు కూడా ఇలాంటి నిర్ధారణలకే చేరుకున్నారు (అనుబంధ చిత్రాలు 4I–J). అందువల్ల, కేవలం MYH పరిమాణీకరణ ఆధారంగా 2X ఫైబర్‌లను ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ స్థాయిలో గుర్తించగలిగినప్పటికీ, మొత్తం ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ లేదా ప్రోటియోమ్‌ను పరిగణనలోకి తీసుకున్నప్పుడు MYH1+ ఫైబర్‌లను ఇతర వేగవంతమైన ఫైబర్‌ల నుండి వేరు చేయడం సాధ్యపడదు.
MYHకు అతీతంగా నెమ్మదైన ఫైబర్ వైవిధ్యంపై ప్రాథమిక అన్వేషణలో భాగంగా, మేము నాలుగు స్థిరపడిన నెమ్మదైన ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట ప్రోటీన్‌లను అంచనా వేశాము: TPM3, TNNT1, MYL3, మరియు ATP2A22. నెమ్మదైన ఫైబర్ ఉపరకాలు ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ (అనుబంధ చిత్రం 5A) మరియు ప్రోటియోమిక్స్ (అనుబంధ చిత్రం 5B) రెండింటిలోనూ MYH7తో సంపూర్ణం కానప్పటికీ, అధిక పియర్సన్ సహసంబంధాలను చూపించాయి. ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ (అనుబంధ చిత్రం 5C) మరియు ప్రోటియోమిక్స్ (అనుబంధ చిత్రం 5D)లలో వరుసగా సుమారు 25% మరియు 33% నెమ్మదైన ఫైబర్‌లు అన్ని జన్యు/ప్రోటీన్ ఉపరకాల ద్వారా స్వచ్ఛమైన నెమ్మదైన ఫైబర్‌లుగా వర్గీకరించబడలేదు. అందువల్ల, బహుళ జన్యు/ప్రోటీన్ ఉపరకాల ఆధారంగా నెమ్మదైన ఫైబర్ వర్గీకరణ, ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్టమైనవిగా తెలిసిన ప్రోటీన్‌ల విషయంలో కూడా అదనపు సంక్లిష్టతను పరిచయం చేస్తుంది. ఇది ఒకే జన్యు/ప్రోటీన్ కుటుంబం యొక్క ఐసోఫామ్‌ల ఆధారంగా ఫైబర్ వర్గీకరణ అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌ల నిజమైన వైవిధ్యాన్ని తగినంతగా ప్రతిబింబించకపోవచ్చని సూచిస్తుంది.
మొత్తం ఓమిక్స్ మోడల్ స్థాయిలో మానవ అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌ల ఫినోటైపిక్ వైవిధ్యాన్ని మరింతగా అన్వేషించడానికి, మేము ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ అనాలిసిస్ (PCA) ఉపయోగించి డేటా యొక్క నిష్పక్షపాత డైమెన్షనాలిటీ రిడక్షన్‌ను నిర్వహించాము (చిత్రం 2A). UMAP ప్లాట్‌ల మాదిరిగానే, PCA స్థాయిలో ఫైబర్ క్లస్టరింగ్‌ను పార్టిసిపెంట్ గానీ లేదా టెస్టింగ్ రోజు గానీ ప్రభావితం చేయలేదు (సప్లిమెంటరీ చిత్రాలు 6A–C). రెండు డేటాసెట్‌లలో, MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకాన్ని PC2 వివరించింది, ఇది స్లో-ట్విచ్ టైప్ 1 ఫైబర్‌ల క్లస్టర్‌ను మరియు ఫాస్ట్-ట్విచ్ టైప్ 2A, టైప్ 2X, మరియు మిశ్రమ 2A/2X ఫైబర్‌లను కలిగి ఉన్న రెండవ క్లస్టర్‌ను చూపించింది (చిత్రం 2A). రెండు డేటాసెట్‌లలో, ఈ రెండు క్లస్టర్‌లు తక్కువ సంఖ్యలో ఉన్న మిశ్రమ టైప్ 1/2A ఫైబర్‌ల ద్వారా అనుసంధానించబడ్డాయి. ఊహించినట్లుగానే, ప్రధాన PC డ్రైవర్‌ల ఓవర్‌రిప్రజెంటేషన్ విశ్లేషణ, PC2 సంకోచ మరియు జీవక్రియ సంకేతాల ద్వారా నడపబడుతుందని నిర్ధారించింది (చిత్రం 2B మరియు సప్లిమెంటరీ చిత్రాలు 6D–E, సప్లిమెంటరీ డేటాసెట్‌లు 5–6). మొత్తం మీద, ఫాస్ట్ క్లస్టర్‌లోని ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ అంతటా విస్తరించి ఉన్న 2X ఫైబర్‌లు అని పిలవబడేవి మినహా, PC2 వెంబడి నిరంతర వైవిధ్యాన్ని వివరించడానికి MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకం సరిపోతుందని కనుగొనబడింది.
A. MYH ఆధారంగా ఫైబర్ రకాన్ని బట్టి రంగులు వేయబడిన ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ మరియు ప్రోటియోమ్ డేటాసెట్ల యొక్క ప్రధాన భాగ విశ్లేషణ (PCA) ప్లాట్లు. B. PC2 మరియు PC1 లలో ట్రాన్స్క్రిప్ట్ మరియు ప్రోటీన్ డ్రైవర్ల యొక్క సుసంపన్నత విశ్లేషణ. క్లస్టర్‌ప్రొఫైలర్ ప్యాకేజీ మరియు బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సర్దుబాటు చేసిన p-విలువలను ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. C, D. ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్‌లోని అంతరకణ సంసంజన జన్యు ఆంటాలజీ (GO) పదాలు మరియు ప్రోటియోమ్‌లోని కోస్టామెర్ GO పదాల ప్రకారం రంగులు వేయబడిన PCA ప్లాట్లు. బాణాలు ట్రాన్స్క్రిప్ట్ మరియు ప్రోటీన్ డ్రైవర్లను మరియు వాటి దిశలను సూచిస్తాయి. E, F. నెమ్మది/వేగవంతమైన ఫైబర్ రకంతో సంబంధం లేకుండా వ్యక్తీకరణ ప్రవణతలను చూపే, వైద్యపరంగా సంబంధిత ఫీచర్ల యొక్క ఏకరీతి మాన్ఫోల్డ్ అప్రాక్సిమేషన్ మరియు ప్రొజెక్షన్ (UMAP) ఫీచర్ ప్లాట్లు. G, H. ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్‌లు మరియు ప్రోటియోమ్‌లలో PC2 మరియు PC1 డ్రైవర్ల మధ్య సహసంబంధాలు.
ఊహించని విధంగా, MYH-ఆధారిత మయోఫైబర్ రకం రెండవ అత్యధిక స్థాయి వైవిధ్యతను (PC2) మాత్రమే వివరించింది, ఇది MYH-ఆధారిత మయోఫైబర్ రకానికి (PC1) సంబంధం లేని ఇతర జీవసంబంధ కారకాలు అస్థిపంజర కండర ఫైబర్ వైవిధ్యతను నియంత్రించడంలో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తాయని సూచిస్తుంది. PC1లోని ప్రధాన కారకాల ఓవర్‌రిప్రజెంటేషన్ విశ్లేషణలో, PC1లోని వైవిధ్యత ప్రధానంగా ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్‌లోని కణ-కణ సంసంజనం మరియు రైబోజోమ్ కంటెంట్ ద్వారా, మరియు ప్రోటియోమ్‌లోని కోస్టామెర్‌లు మరియు రైబోజోమల్ ప్రోటీన్‌ల ద్వారా నిర్ణయించబడిందని వెల్లడైంది (పటం 2B మరియు అనుబంధ పటాలు 6D–E, అనుబంధ డేటా సెట్ 7). అస్థిపంజర కండరంలో, కోస్టామెర్‌లు Z-డిస్క్‌ను సార్కోలెమ్మాకు కలుపుతాయి మరియు బల ప్రసారం మరియు సిగ్నలింగ్‌లో పాల్గొంటాయి. 25 కణ-కణ సంసంజనం (ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్, పటం 2C) మరియు కోస్టామెర్ (ప్రోటియోమ్, పటం 2D) ఫీచర్‌లను ఉపయోగించి వ్యాఖ్యానించిన PCA ప్లాట్‌లు PC1లో బలమైన లెఫ్ట్ షిఫ్ట్‌ను వెల్లడించాయి, ఈ ఫీచర్‌లు కొన్ని ఫైబర్‌లలో సమృద్ధిగా ఉన్నాయని సూచిస్తున్నాయి.
UMAP స్థాయిలో మయోఫైబర్ క్లస్టరింగ్‌ను మరింత వివరంగా పరిశీలించినప్పుడు, చాలా లక్షణాలు మయోఫైబర్ సబ్‌క్లస్టర్-నిర్దిష్టంగా కాకుండా, మయోఫైబర్ రకంపై ఆధారపడని MYH-ఆధారిత ఎక్స్‌ప్రెషన్ గ్రేడియంట్‌ను ప్రదర్శించాయని వెల్లడైంది. CHCHD10 (న్యూరోమస్కులర్ వ్యాధి), SLIT3 (కండరాల క్షీణత), CTDNEP1 (కండరాల వ్యాధి) వంటి వ్యాధి సంబంధిత పరిస్థితులతో ముడిపడి ఉన్న అనేక జన్యువులలో ఈ కొనసాగింపు గమనించబడింది (పటం 2E). నాడీ సంబంధిత రుగ్మతలు (UGDH), ఇన్సులిన్ సిగ్నలింగ్ (PHIP), మరియు ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ (HIST1H2AB)లతో సంబంధం ఉన్న ప్రోటీన్‌లతో సహా ప్రోటీయోమ్ అంతటా కూడా ఈ కొనసాగింపు గమనించబడింది (పటం 2F). సమిష్టిగా, ఈ డేటా వివిధ మయోఫైబర్‌లలో ఫైబర్ రకంపై ఆధారపడని నెమ్మది/వేగవంతమైన ట్విచ్ వైవిధ్యంలో కొనసాగింపును సూచిస్తుంది.
ఆసక్తికరంగా, PC2లోని డ్రైవర్ జన్యువులు మంచి ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్-ప్రోటియోమ్ సహసంబంధాన్ని (r = 0.663) చూపించాయి (పటం 2G), ఇది నెమ్మదైన మరియు వేగవంతమైన-ట్విచ్ ఫైబర్ రకాలు, మరియు ముఖ్యంగా అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌ల సంకోచ మరియు జీవక్రియ లక్షణాలు ట్రాన్స్క్రిప్షనల్‌గా నియంత్రించబడతాయని సూచిస్తుంది. అయితే, PC1లోని డ్రైవర్ జన్యువులు ఎటువంటి ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్-ప్రోటియోమ్ సహసంబంధాన్ని (r = -0.027) చూపించలేదు (పటం 2H), ఇది నెమ్మదైన/వేగవంతమైన-ట్విచ్ ఫైబర్ రకాలకు సంబంధం లేని వైవిధ్యాలు ఎక్కువగా పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షనల్‌గా నియంత్రించబడతాయని సూచిస్తుంది. PC1లోని వైవిధ్యాలు ప్రధానంగా రైబోసోమల్ జన్యు ఆంటాలజీ పదాల ద్వారా వివరించబడినందున, మరియు రైబోజోమ్‌లు కణంలో ప్రోటీన్ అనువాదంలో చురుకుగా పాల్గొని, ప్రభావితం చేయడం ద్వారా కీలకమైన మరియు ప్రత్యేకమైన పాత్రను పోషిస్తాయి కాబట్టి,31 మేము తదుపరి ఈ ఊహించని రైబోసోమల్ భిన్నత్వాన్ని పరిశోధించడానికి పూనుకున్నాము.
మేము మొదటగా, GOCC పదం "సైటోప్లాస్మిక్ రైబోజోమ్"లోని ప్రోటీన్ల సాపేక్ష సమృద్ధి ప్రకారం ప్రోటీయోమిక్స్ ప్రధాన భాగ విశ్లేషణ ప్లాట్‌కు రంగులు వేశాము (పటం 3A). ఈ పదం PC1 యొక్క ధనాత్మక వైపున సమృద్ధిగా ఉండి, ఒక చిన్న గ్రేడియంట్‌కు దారితీసినప్పటికీ, రైబోజోమల్ ప్రోటీన్లు PC1 యొక్క రెండు దిశలలోనూ విభజనను నడిపిస్తాయి (పటం 3A). PC1 యొక్క రుణాత్మక వైపున సమృద్ధిగా ఉన్న రైబోజోమల్ ప్రోటీన్లలో RPL18, RPS18, మరియు RPS13 ఉన్నాయి (పటం 3B), అయితే RPL31, RPL35, మరియు RPL38 (పటం 3C) PC1 యొక్క ధనాత్మక వైపున ప్రధాన చోదకాలుగా ఉన్నాయి. ఆసక్తికరంగా, ఇతర కణజాలాలతో పోలిస్తే అస్థిపంజర కండరాలలో RPL38 మరియు RPS13 అధికంగా వ్యక్తమయ్యాయి (అనుబంధ పటం 7A). PC1లోని ఈ విలక్షణమైన రైబోజోమల్ సంకేతాలు ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్‌లో గమనించబడలేదు (అనుబంధ పటం 7B), ఇది పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ నియంత్రణను సూచిస్తుంది.
A. ప్రోటీయోమ్ అంతటా సైటోప్లాస్మిక్ రైబోసోమల్ జీన్ ఆంటాలజీ (GO) పదాల ప్రకారం రంగులు వేయబడిన ప్రధాన భాగ విశ్లేషణ (PCA) ప్లాట్. PCA ప్లాట్‌లో ప్రోటీన్-మధ్యవర్తిత్వ వైవిధ్యం యొక్క దిశను బాణాలు సూచిస్తాయి. లైన్ పొడవు ఒక నిర్దిష్ట ప్రోటీన్ కోసం ప్రధాన భాగ స్కోర్‌కు అనుగుణంగా ఉంటుంది. B, C. RPS13 మరియు RPL38 కోసం PCA ఫీచర్ ప్లాట్లు. D. సైటోప్లాస్మిక్ రైబోసోమల్ ప్రోటీన్ల యొక్క పర్యవేక్షించని క్రమానుగత క్లస్టరింగ్ విశ్లేషణ. E. అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లలో విభిన్న సమృద్ధిని కలిగి ఉన్న రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌లను హైలైట్ చేసే 80S రైబోసోమ్ (PDB: 4V6X) యొక్క నిర్మాణాత్మక నమూనా. F. mRNA నిష్క్రమణ ఛానల్ సమీపంలో స్థానికీకరించబడిన విభిన్న స్టోయికియోమెట్రీతో రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లు.
రైబోజోమల్ భిన్నత్వం మరియు ప్రత్యేకత అనే భావనలు గతంలో ప్రతిపాదించబడ్డాయి, దీని ప్రకారం విభిన్న రైబోజోమ్ ఉపజనాభా (రైబోజోమల్ భిన్నత్వం) ఉండటం అనేది నిర్దిష్ట mRNA ట్రాన్స్క్రిప్ట్ పూల్స్ యొక్క ఎంపిక చేసిన అనువాదం (రైబోజోమ్ ప్రత్యేకత) ద్వారా వివిధ కణజాలాలు32 మరియు కణాలలో33 ప్రోటీన్ అనువాదాన్ని నేరుగా ప్రభావితం చేస్తుంది. అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లలో సహ-వ్యక్తమయ్యే రైబోజోమల్ ప్రోటీన్ల ఉపజనాభాను గుర్తించడానికి, మేము ప్రోటియోమ్‌లోని రైబోజోమల్ ప్రోటీన్లపై పర్యవేక్షించని క్రమానుగత క్లస్టరింగ్ విశ్లేషణను నిర్వహించాము (చిత్రం 3D, అనుబంధ డేటా సెట్ 8). ఊహించినట్లుగానే, రైబోజోమల్ ప్రోటీన్లు MYH ఆధారంగా ఫైబర్ రకం ప్రకారం క్లస్టర్ కాలేదు. అయితే, మేము రైబోజోమల్ ప్రోటీన్ల యొక్క మూడు విభిన్న క్లస్టర్‌లను గుర్తించాము; మొదటి క్లస్టర్ (ribosomal_cluster_1) RPL38తో సహ-నియంత్రించబడుతుంది మరియు అందువల్ల సానుకూల PC1 ప్రొఫైల్ ఉన్న ఫైబర్‌లలో దీని వ్యక్తీకరణ పెరుగుతుంది. రెండవ క్లస్టర్ (ribosomal_cluster_2) RPS13తో సహ-నియంత్రించబడుతుంది మరియు ప్రతికూల PC1 ప్రొఫైల్ ఉన్న ఫైబర్‌లలో ఇది అధికంగా ఉంటుంది. మూడవ క్లస్టర్ (రైబోసోమల్_క్లస్టర్_3) అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లలో సమన్వయంతో కూడిన భేదాత్మక వ్యక్తీకరణను చూపదు మరియు దీనిని "కోర్" అస్థిపంజర కండర రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌గా పరిగణించవచ్చు. రైబోసోమల్ క్లస్టర్‌లు 1 మరియు 2 రెండింటిలోనూ రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌లు ఉన్నాయి, ఇవి గతంలో ప్రత్యామ్నాయ అనువాదాన్ని (ఉదా, RPL10A, RPL38, RPS19, మరియు RPS25) నియంత్రిస్తాయని మరియు అభివృద్ధిని క్రియాత్మకంగా ప్రభావితం చేస్తాయని (ఉదా, RPL10A, RPL38) చూపబడింది.34,35,36,37,38 PCA ఫలితాలకు అనుగుణంగా, ఫైబర్‌ల అంతటా ఈ రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క గమనించిన భిన్నమైన ప్రాతినిధ్యం కూడా కొనసాగింపును చూపింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 7C).
రైబోజోమ్‌లోని విజాతీయ రైబోజోమల్ ప్రోటీన్‌ల స్థానాన్ని దృశ్యమానం చేయడానికి, మేము మానవ 80S రైబోజోమ్ యొక్క నిర్మాణ నమూనాను (ప్రోటీన్ డేటా బ్యాంక్: 4V6X) ఉపయోగించాము (పటం 3E). వేర్వేరు రైబోజోమల్ క్లస్టర్‌లకు చెందిన రైబోజోమల్ ప్రోటీన్‌లను వేరు చేసిన తర్వాత, వాటి స్థానాలు దగ్గరగా అమరలేదు. ఇది, రైబోజోమ్‌లోని కొన్ని ప్రాంతాలు/భాగాలను సుసంపన్నం చేయడంలో మా విధానం విఫలమైందని సూచిస్తుంది. అయితే, ఆసక్తికరంగా, క్లస్టర్ 2లోని పెద్ద సబ్‌యూనిట్ ప్రోటీన్‌ల నిష్పత్తి క్లస్టర్‌లు 1 మరియు 3 కంటే తక్కువగా ఉంది (అనుబంధ పటం 7D). అస్థిపంజర కండర తంతువులలో మార్పు చెందిన స్టోయికియోమెట్రీ కలిగిన ప్రోటీన్‌లు ప్రధానంగా రైబోజోమ్ ఉపరితలంపై కేంద్రీకృతమై ఉన్నాయని మేము గమనించాము (పటం 3E). ఇది, వివిధ mRNA సమూహాలలో ఇంటర్నల్ రైబోజోమ్ ఎంట్రీ సైట్ (IRES) మూలకాలతో సంకర్షణ చెందే వాటి సామర్థ్యానికి అనుగుణంగా ఉంది, తద్వారా ఎంపిక చేసిన అనువాదాన్ని సమన్వయం చేస్తుంది. 40, 41 ఇంకా, అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లలో మార్చబడిన స్టోయికియోమెట్రీతో కూడిన అనేక ప్రోటీన్లు mRNA ఎగ్జిట్ టన్నెల్ (చిత్రం 3F) వంటి క్రియాత్మక ప్రాంతాలకు సమీపంలో ఉన్నాయి, ఇవి నిర్దిష్ట పెప్టైడ్‌ల యొక్క అనువాద పొడిగింపు మరియు నిలుపుదలను ఎంపికగా నియంత్రిస్తాయి. 42 సారాంశంలో, అస్థిపంజర కండర రైబోసోమల్ ప్రోటీన్ల స్టోయికియోమెట్రీ భిన్నత్వాన్ని ప్రదర్శిస్తుందని, ఫలితంగా అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌ల మధ్య తేడాలు ఏర్పడతాయని మా డేటా సూచిస్తుంది.
తరువాత మేము వేగంగా మరియు నెమ్మదిగా సంకోచించే ఫైబర్ సిగ్నేచర్‌లను గుర్తించడానికి మరియు వాటి ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ నియంత్రణ యొక్క యంత్రాంగాలను అన్వేషించడానికి బయలుదేరాము. రెండు డేటాసెట్‌లలో (మూర్తులు 1G–H మరియు 4A–B) UMAP ద్వారా నిర్వచించబడిన వేగంగా మరియు నెమ్మదిగా సంకోచించే ఫైబర్ క్లస్టర్‌లను పోల్చి చూసినప్పుడు, ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటియోమిక్ విశ్లేషణలు వరుసగా 1366 మరియు 804 విభిన్నంగా సమృద్ధిగా ఉన్న లక్షణాలను గుర్తించాయి (మూర్తులు 4A–B, అనుబంధ డేటాసెట్‌లు 9–12). సార్కోమెర్‌లకు (ఉదాహరణకు, ట్రోపోమయోసిన్ మరియు ట్రోపోనిన్), ఎక్సైటేషన్-కాంట్రాక్షన్ కప్లింగ్‌కు (SERCA ఐసోఫామ్‌లు), మరియు శక్తి జీవక్రియకు (ఉదాహరణకు, ALDOA మరియు CKB) సంబంధించిన సిగ్నేచర్‌లలో ఊహించిన తేడాలను మేము గమనించాము. అంతేకాకుండా, ప్రోటీన్ యుబిక్విటినేషన్‌ను నియంత్రించే ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు మరియు ప్రోటీన్లు వేగంగా మరియు నెమ్మదిగా సంకోచించే ఫైబర్‌లలో విభిన్నంగా వ్యక్తమయ్యాయి (ఉదాహరణకు, USP54, SH3RF2, USP28, మరియు USP48) (మూర్తులు 4A–B). అంతేకాకుండా, గొర్రెపిల్ల కండర ఫైబర్ రకాలలో విభిన్నంగా వ్యక్తీకరించబడుతుందని గతంలో చూపబడిన43 మరియు గుండె కండరాలలో SERCA కార్యాచరణను పెంచే44 సూక్ష్మజీవి ప్రోటీన్ జన్యువు RP11-451G4.2 (DWORF), నెమ్మదిగా ఉండే అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లలో గణనీయంగా అప్‌రెగ్యులేట్ చేయబడింది (చిత్రం 4A). అదేవిధంగా, వ్యక్తిగత ఫైబర్ స్థాయిలో, జీవక్రియ-సంబంధిత లాక్టేట్ డీహైడ్రోజినేస్ ఐసోఫార్మ్‌లు (LDHA మరియు LDHB, చిత్రం 4C మరియు అనుబంధ చిత్రం 8A)45,46 వంటి తెలిసిన సిగ్నేచర్‌లలో, అలాగే గతంలో తెలియని ఫైబర్-రకం-నిర్దిష్ట సిగ్నేచర్‌లలో (IRX3, USP54, USP28, మరియు DPYSL3 వంటివి) గణనీయమైన తేడాలు గమనించబడ్డాయి (చిత్రం 4C). ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటియోమిక్ డేటాసెట్‌ల మధ్య విభిన్నంగా వ్యక్తీకరించబడిన ఫీచర్లలో గణనీయమైన అతివ్యాప్తి ఉంది (అనుబంధ చిత్రం 8B), అలాగే ప్రధానంగా సార్కోమెర్ ఫీచర్ల యొక్క మరింత స్పష్టమైన విభిన్న వ్యక్తీకరణ ద్వారా నడిచే ఫోల్డ్ చేంజ్ సహసంబంధం కూడా ఉంది (అనుబంధ చిత్రం 8C). ముఖ్యంగా, కొన్ని సిగ్నేచర్‌లు (ఉదా. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) ప్రోటీయోమిక్ స్థాయిలో మాత్రమే బలమైన పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ నియంత్రణను చూపించాయి మరియు నెమ్మది/వేగవంతమైన ట్విచ్ ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌లను కలిగి ఉన్నాయి (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 8C).
చిత్రాలు 1G–Hలోని యూనిఫార్మ్ మానిఫోల్డ్ అప్రాక్సిమేషన్ అండ్ ప్రొజెక్షన్ (UMAP) ప్లాట్‌ల ద్వారా గుర్తించబడిన నెమ్మది మరియు వేగవంతమైన క్లస్టర్‌లను పోల్చే A మరియు B వోల్కానో ప్లాట్‌లు. రంగు చుక్కలు FDR < 0.05 వద్ద గణనీయంగా భిన్నంగా ఉండే ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు లేదా ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తాయి, మరియు ముదురు చుక్కలు లాగ్ చేంజ్ > 1 వద్ద గణనీయంగా భిన్నంగా ఉండే ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు లేదా ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తాయి. బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సర్దుబాటు చేసిన p విలువలతో DESeq2 వాల్డ్ పరీక్షను (ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్స్) లేదా బహుళ పోలికల కోసం బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సర్దుబాటు తర్వాత అనుభావిక బయేసియన్ విశ్లేషణతో కూడిన లిమ్మా లీనియర్ మోడల్ పద్ధతిని (ప్రోటియోమిక్స్) ఉపయోగించి ద్విముఖ గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. C నెమ్మది మరియు వేగవంతమైన ఫైబర్‌ల మధ్య ఎంపిక చేయబడిన భేదాత్మకంగా వ్యక్తమయ్యే జన్యువులు లేదా ప్రోటీన్‌ల సిగ్నేచర్ ప్లాట్‌లు. D గణనీయంగా భేదాత్మకంగా వ్యక్తమయ్యే ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌ల సుసంపన్నత విశ్లేషణ. రెండు డేటాసెట్‌లలోనూ అతివ్యాప్తి చెందుతున్న విలువలు సమృద్ధిగా ఉన్నాయి, ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ విలువలు కేవలం ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్‌లో మాత్రమే సమృద్ధిగా ఉన్నాయి, మరియు ప్రోటియోమ్ విలువలు కేవలం ప్రోటియోమ్‌లో మాత్రమే సమృద్ధిగా ఉన్నాయి. బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సర్దుబాటు చేసిన p-విలువలతో క్లస్టర్‌ప్రొఫైలర్ ప్యాకేజీని ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. E. SCENIC-ఉత్పన్న రెగ్యులేటర్ స్పెసిఫిసిటీ స్కోర్‌లు మరియు ఫైబర్ రకాల మధ్య భేదాత్మక mRNA వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా SCENIC ద్వారా గుర్తించబడిన ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకాలు. F. నెమ్మది మరియు వేగవంతమైన ఫైబర్‌ల మధ్య భేదాత్మకంగా వ్యక్తీకరించబడిన ఎంపిక చేసిన ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కారకాల ప్రొఫైలింగ్.
తరువాత మేము విభిన్నంగా ప్రాతినిధ్యం వహించే జన్యువులు మరియు ప్రోటీన్ల యొక్క అధిక ప్రాతినిధ్య విశ్లేషణను నిర్వహించాము (మూర్తి 4D, అనుబంధ డేటా సెట్ 13). రెండు డేటాసెట్‌ల మధ్య తేడా ఉన్న లక్షణాల కోసం మార్గ సుసంపన్నత ఊహించిన తేడాలను వెల్లడించింది, అవి కొవ్వు ఆమ్లం β-ఆక్సీకరణ మరియు కీటోన్ జీవక్రియ ప్రక్రియలు (నెమ్మది ఫైబర్‌లు), మైయోఫిలమెంట్/కండరాల సంకోచం (వరుసగా వేగవంతమైన మరియు నెమ్మది ఫైబర్‌లు), మరియు కార్బోహైడ్రేట్ విచ్ఛిన్న ప్రక్రియలు (వేగవంతమైన ఫైబర్‌లు). గ్లైకోజెన్ జీవక్రియను నియంత్రిస్తాయని తెలిసిన నియంత్రణ మరియు ఉత్ప్రేరక ఫాస్ఫేటేస్ సబ్‌యూనిట్‌లు (PPP3CB, PPP1R3D, మరియు PPP1R3A) వంటి లక్షణాల ద్వారా ప్రేరేపించబడిన సెరైన్/త్రెయోనిన్ ప్రోటీన్ ఫాస్ఫేటేస్ కార్యాచరణ కూడా వేగవంతమైన ఫైబర్‌లలో పెరిగింది (47) (అనుబంధ మూర్తులు 8D–E). వేగవంతమైన ఫైబర్‌లలో సమృద్ధిగా ఉన్న ఇతర మార్గాలలో ప్రోటీయోమ్‌లోని ప్రాసెసింగ్ (P-) బాడీలు (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 8F), పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ రెగ్యులేషన్‌లో (48) పాల్గొనే అవకాశం ఉంది, మరియు ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్‌లోని ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్ యాక్టివిటీ (SREBF1, RXRG, RORA) (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 8G) ఉన్నాయి. నెమ్మదైన ఫైబర్‌లు ఆక్సిడోరిడక్టేస్ యాక్టివిటీ (BDH1, DCXR, TXN2) (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 8H), అమైడ్ బైండింగ్ (CPTP, PFDN2, CRYAB) (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 8I), ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ మ్యాట్రిక్స్ (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 8J), మరియు రిసెప్టర్-లిగాండ్ యాక్టివిటీ (FNDC5, SPX, NENF) (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 8K) లలో సమృద్ధిగా ఉన్నాయి.
నెమ్మది/వేగవంతమైన కండర తంతువుల రకం లక్షణాలకు ఆధారమైన లిప్యంతరీకరణ నియంత్రణపై మరింత అవగాహన పొందడానికి, మేము SCENIC49 (అనుబంధ డేటా సెట్ 14) ఉపయోగించి లిప్యంతరీకరణ కారకాల సమృద్ధి విశ్లేషణను నిర్వహించాము. వేగవంతమైన మరియు నెమ్మది కండర తంతువుల మధ్య అనేక లిప్యంతరీకరణ కారకాలు గణనీయంగా సమృద్ధిగా ఉన్నాయి (పటం 4E). ఇందులో, గతంలో వేగవంతమైన కండర తంతువుల అభివృద్ధికి ముడిపడి ఉన్న MAFA వంటి లిప్యంతరీకరణ కారకాలు, అలాగే గతంలో కండర తంతువుల రకం-నిర్దిష్ట జన్యు కార్యక్రమాలతో సంబంధం లేని అనేక లిప్యంతరీకరణ కారకాలు ఉన్నాయి. వీటిలో, PITX1, EGR1, మరియు MYF6 వేగవంతమైన కండర తంతువులలో అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న లిప్యంతరీకరణ కారకాలు (పటం 4E). దీనికి విరుద్ధంగా, ZSCAN30 మరియు EPAS1 (HIF2A అని కూడా పిలుస్తారు) నెమ్మది కండర తంతువులలో అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న లిప్యంతరీకరణ కారకాలు (పటం 4E). దీనికి అనుగుణంగా, వేగవంతమైన కండర తంతువులకు సంబంధించిన UMAP ప్రాంతంలో MAFA అధిక స్థాయిలో వ్యక్తమైంది, అయితే EPAS1 వ్యతిరేక వ్యక్తీకరణ నమూనాను కలిగి ఉంది (పటం 4F).
తెలిసిన ప్రోటీన్-కోడింగ్ జన్యువులతో పాటు, మానవ అభివృద్ధి మరియు వ్యాధి నియంత్రణలో పాలుపంచుకునే అనేక నాన్-కోడింగ్ RNA బయోటైప్‌లు ఉన్నాయి. 51, 52 ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ డేటాసెట్లలో, అనేక నాన్-కోడింగ్ RNAలు ఫైబర్ రకం విశిష్టతను ప్రదర్శిస్తాయి (చిత్రం 5A మరియు అనుబంధ డేటాసెట్ 15), వీటిలో LINC01405 కూడా ఉంది, ఇది నెమ్మదైన ఫైబర్‌లకు అత్యంత విశిష్టమైనది మరియు మైటోకాండ్రియల్ మయోపతి ఉన్న రోగుల కండరాలలో ఇది తగ్గినట్లు నివేదించబడింది. 53 దీనికి విరుద్ధంగా, lnc-ERCC5-5 జన్యువుకు (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 అనుగుణంగా ఉండే RP11-255P5.3, వేగవంతమైన ఫైబర్ రకం విశిష్టతను ప్రదర్శిస్తుంది. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) మరియు RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) రెండూ అస్థిపంజర కండరాల ప్రత్యేకతను ప్రదర్శిస్తాయి (అనుబంధ చిత్రాలు 9A–B) మరియు వాటి 1 Mb జన్యు పరిసరాల్లో తెలిసిన సంకోచ జన్యువులు ఏవీ లేవు. ఇది, అవి పొరుగున ఉన్న సంకోచ జన్యువులను నియంత్రించడం కంటే ఫైబర్ రకాలను నియంత్రించడంలో ఒక ప్రత్యేక పాత్ర పోషిస్తాయని సూచిస్తుంది. వరుసగా LINC01405 మరియు RP11-255P5.3 యొక్క నెమ్మది/వేగవంతమైన ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌లు RNAscope ఉపయోగించి నిర్ధారించబడ్డాయి (చిత్రాలు 5B–C).
A. నెమ్మదైన మరియు వేగవంతమైన కండర తంతువులలో నాన్-కోడింగ్ RNA ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు గణనీయంగా నియంత్రించబడతాయి. B. వరుసగా LINC01405 మరియు RP11-255P5.3 యొక్క నెమ్మదైన మరియు వేగవంతమైన తంతువుల రకం విశిష్టతను చూపే ప్రతినిధి RNAscope చిత్రాలు. స్కేల్ బార్ = 50 μm. C. RNAscope ద్వారా నిర్ధారించబడినట్లుగా, మయోఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట నాన్-కోడింగ్ RNA వ్యక్తీకరణ యొక్క పరిమాణీకరణ (n = 3 స్వతంత్ర వ్యక్తుల నుండి బయాప్సీలు, ప్రతి వ్యక్తిలోని వేగవంతమైన మరియు నెమ్మదైన కండర తంతువులను పోల్చడం). రెండు-వైపుల స్టూడెంట్స్ t-పరీక్షను ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. బాక్స్ ప్లాట్‌లు మధ్యస్థం మరియు మొదటి మరియు మూడవ క్వార్టైల్‌లను చూపుతాయి, విస్కర్‌లు కనిష్ట మరియు గరిష్ట విలువలను సూచిస్తాయి. D. డి నోవో మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్ గుర్తింపు వర్క్‌ఫ్లో (BioRender.comతో సృష్టించబడింది). E. LINC01405_ORF408:17441:17358 అనే సూక్ష్మజీవి ప్రోటీన్ నెమ్మదిగా ఉండే అస్థిపంజర కండర తంతువులలో ప్రత్యేకంగా వ్యక్తమవుతుంది (స్వతంత్రంగా పాల్గొన్నవారి నుండి తీసుకున్న 5 బయాప్సీలు, ప్రతి పాల్గొన్నవారిలో వేగవంతమైన మరియు నెమ్మదైన కండర తంతువులను పోల్చడం). గణాంక విశ్లేషణను లిమ్ లీనియర్ మోడల్ పద్ధతిని అనుభావిక బయేసియన్ విధానంతో కలిపి ఉపయోగించి నిర్వహించారు, ఆ తర్వాత p-విలువ సర్దుబాటుతో బహుళ పోలికల కోసం బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ పద్ధతిని అనుసరించారు. బాక్స్ ప్లాట్‌లు మధ్యస్థం, మొదటి మరియు మూడవ క్వార్టైల్‌లను చూపుతాయి, విస్కర్‌లు గరిష్ట/కనిష్ట విలువలను సూచిస్తాయి.
ఇటీవలి అధ్యయనాలు అనేక ఊహాజనిత నాన్-కోడింగ్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌లు ట్రాన్స్క్రైబ్ చేయబడిన మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్‌లను ఎన్‌కోడ్ చేస్తాయని చూపించాయి, వాటిలో కొన్ని కండరాల పనితీరును నియంత్రిస్తాయి. 44, 55 సంభావ్య ఫైబర్ రకం విశిష్టత కలిగిన మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్‌లను గుర్తించడానికి, మేము 1000 ఫైబర్ ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ డేటాసెట్‌లో కనుగొనబడిన నాన్-కోడింగ్ ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌ల (n = 305) సీక్వెన్స్‌లను కలిగి ఉన్న ఒక కస్టమ్ FASTA ఫైల్‌ను ఉపయోగించి మా 1000 ఫైబర్ ప్రోటీయోమ్ డేటాసెట్‌ను శోధించాము (చిత్రం 5D). మేము 22 విభిన్న ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌ల నుండి 197 మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్‌లను గుర్తించాము, వాటిలో 71 నెమ్మది మరియు వేగవంతమైన అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌ల మధ్య విభిన్నంగా నియంత్రించబడ్డాయి (అనుబంధ చిత్రం 9C మరియు అనుబంధ డేటా సెట్ 16). LINC01405 కొరకు, మూడు మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్ ఉత్పత్తులు గుర్తించబడ్డాయి, వాటిలో ఒకటి దాని ట్రాన్స్క్రిప్ట్‌కు సమానమైన నెమ్మది ఫైబర్ విశిష్టతను చూపించింది (చిత్రం 5E మరియు అనుబంధ చిత్రం 9D). అందువల్ల, మేము LINC01405ను నెమ్మది అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లకు ప్రత్యేకమైన మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్‌ను ఎన్‌కోడ్ చేసే జన్యువుగా గుర్తించాము.
మేము వ్యక్తిగత కండర తంతువుల యొక్క పెద్ద-స్థాయి ప్రోటీయోమిక్ లక్షణీకరణ కోసం ఒక సమగ్ర కార్యప్రవాహాన్ని అభివృద్ధి చేసాము మరియు ఆరోగ్యకరమైన స్థితులలో తంతువుల వైవిధ్యత యొక్క నియంత్రకాలను గుర్తించాము. నెమలైన్ మయోపతీలు అస్థిపంజర కండర తంతువుల వైవిధ్యతను ఎలా ప్రభావితం చేస్తాయో అర్థం చేసుకోవడానికి మేము ఈ కార్యప్రవాహాన్ని వర్తింపజేసాము. నెమలైన్ మయోపతీలు అనేవి వంశపారంపర్యంగా వచ్చే కండర వ్యాధులు, ఇవి కండరాల బలహీనతకు కారణమవుతాయి మరియు ప్రభావితమైన పిల్లలలో, శ్వాసకోశ ఇబ్బంది, స్కోలియోసిస్ మరియు పరిమిత అవయవ చలనశీలత వంటి అనేక రకాల సమస్యలతో కనిపిస్తాయి. 19,20 సాధారణంగా, నెమలైన్ మయోపతీలలో, యాక్టిన్ ఆల్ఫా 1 (ACTA1) వంటి జన్యువులలోని వ్యాధికారక వైవిధ్యాలు, మయోఫైబర్ కూర్పులో స్లో-ట్విచ్ ఫైబర్‌ల ఆధిపత్యానికి దారితీస్తాయి, అయినప్పటికీ ఈ ప్రభావం వైవిధ్యభరితంగా ఉంటుంది. ఒక ముఖ్యమైన మినహాయింపు ట్రోపోనిన్ టి1 నెమలైన్ మయోపతీ (TNNT1), దీనిలో ఫాస్ట్ ఫైబర్‌లు ఆధిపత్యం వహిస్తాయి. అందువల్ల, నెమలైన్ మయోపతీలలో గమనించిన అస్థిపంజర కండర తంతువుల అస్తవ్యస్తతకు కారణమయ్యే వైవిధ్యతను బాగా అర్థం చేసుకోవడం, ఈ వ్యాధులు మరియు మయోఫైబర్ రకం మధ్య ఉన్న సంక్లిష్ట సంబంధాన్ని విడదీయడానికి సహాయపడవచ్చు.
ఆరోగ్యకరమైన నియంత్రణ సమూహంతో (ప్రతి సమూహానికి n=3) పోల్చినప్పుడు, ACTA1 మరియు TNNT1 జన్యువులలో ఉత్పరివర్తనలు ఉన్న నెమలైన్ మయోపతీ రోగుల నుండి వేరుచేయబడిన కండర తంతువులు గుర్తించదగిన కండర తంతువుల క్షీణత లేదా బలహీనతను చూపించాయి (పటం 6A, అనుబంధ పట్టిక 3). అందుబాటులో ఉన్న పదార్థం పరిమితంగా ఉండటం వలన ఇది ప్రోటీయోమిక్ విశ్లేషణకు గణనీయమైన సాంకేతిక సవాళ్లను సృష్టించింది. అయినప్పటికీ, మేము 272 అస్థిపంజర కండర తంతువులలో 2485 ప్రోటీన్‌లను గుర్తించగలిగాము. ప్రతి తంతువుకు కనీసం 1000 పరిమాణీకరించబడిన ప్రోటీన్‌లను వడపోసిన తర్వాత, 250 తంతువులను తదుపరి బయోఇన్ఫర్మాటిక్స్ విశ్లేషణకు గురిచేయడం జరిగింది. వడపోసిన తర్వాత, ప్రతి తంతువుకు సగటున 1573 ± 359 ప్రోటీన్‌లు పరిమాణీకరించబడ్డాయి (అనుబంధ పటం 10A, అనుబంధ డేటా సెట్‌లు 17–18). ముఖ్యంగా, తంతువుల పరిమాణంలో గణనీయమైన తగ్గుదల ఉన్నప్పటికీ, నెమలైన్ మయోపతీ రోగి నమూనాల ప్రోటీయోమ్ లోతు కేవలం స్వల్పంగా మాత్రమే తగ్గింది. అంతేకాకుండా, మా స్వంత FASTA ఫైల్‌లను (నాన్-కోడింగ్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లతో సహా) ఉపయోగించి ఈ డేటాను ప్రాసెస్ చేయడం ద్వారా, నెమలైన్ మయోపతి రోగుల నుండి సేకరించిన అస్థిపంజర కండర తంతువులలో ఐదు సూక్ష్మజీవి ప్రోటీన్‌లను గుర్తించగలిగాము (అనుబంధ డేటా సెట్ 19). ప్రోటియోమ్ యొక్క డైనమిక్ రేంజ్ గణనీయంగా విస్తృతంగా ఉంది, మరియు నియంత్రణ సమూహంలోని మొత్తం ప్రోటీన్లు మునుపటి 1000-ఫైబర్ ప్రోటియోమ్ విశ్లేషణ ఫలితాలతో బాగా సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి (అనుబంధ చిత్రం 10B–C).
A. ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలలో (NM), MYH ఆధారంగా ఫైబర్ క్షీణత లేదా డిస్ట్రోఫీ మరియు వివిధ ఫైబర్ రకాల ప్రాబల్యాన్ని చూపే సూక్ష్మదర్శిని చిత్రాలు. స్కేల్ బార్ = 100 μm. ACTA1 మరియు TNNT1 రోగులలో స్టెయినింగ్ పునరుత్పత్తిని నిర్ధారించడానికి, ప్రతినిధి చిత్రాలను ఎంచుకోవడానికి ముందు ముగ్గురు రోగుల బయాప్సీలకు రెండు నుండి మూడు సార్లు (ఒక్కో కేసుకు నాలుగు విభాగాలు) స్టెయినింగ్ చేయబడింది. B. MYH ఆధారంగా పాల్గొన్నవారిలో ఫైబర్ రకాల నిష్పత్తులు. C. నెమలైన్ మయోపతీలు ఉన్న రోగులు మరియు నియంత్రణ సమూహంలోని అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌ల యొక్క ప్రధాన భాగ విశ్లేషణ (PCA) ప్లాట్. D. నెమలైన్ మయోపతీలు ఉన్న రోగులు మరియు నియంత్రణ సమూహంలోని అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లు, చిత్రం 2లో విశ్లేషించబడిన 1000 ఫైబర్‌ల నుండి నిర్ణయించబడిన PCA ప్లాట్‌పైకి ప్రొజెక్ట్ చేయబడ్డాయి. ఉదాహరణకు, ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలు ఉన్న పాల్గొన్నవారు మరియు నియంత్రణ సమూహం మధ్య, మరియు ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలు ఉన్న పాల్గొన్నవారి మధ్య తేడాలను పోల్చే వోల్కనో ప్లాట్‌లు. రంగు వలయాలు π < 0.05 వద్ద గణనీయంగా భిన్నంగా ఉన్న ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తాయి, మరియు ముదురు చుక్కలు FDR < 0.05 వద్ద గణనీయంగా భిన్నంగా ఉన్న ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తాయి. లిమ్మా లీనియర్ మోడల్ పద్ధతి మరియు అనుభావిక బయేసియన్ పద్ధతులను ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది, ఆ తర్వాత బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ పద్ధతిని ఉపయోగించి బహుళ పోలికల కోసం p-విలువ సర్దుబాటు చేయబడింది. H. మొత్తం ప్రోటియోమ్ అంతటా మరియు టైప్ 1 మరియు 2A ఫైబర్‌లలో గణనీయంగా భిన్నంగా వ్యక్తమయ్యే ప్రోటీన్‌ల సుసంపన్నత విశ్లేషణ. క్లస్టర్‌ప్రొఫైలర్ ప్యాకేజీ మరియు బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సర్దుబాటు చేసిన p-విలువలను ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. I, J. కణబాహ్య మాత్రిక మరియు మైటోకాండ్రియల్ జన్యు ఆంటాలజీ (GO) పదాల ద్వారా రంగులు వేయబడిన ప్రధాన భాగ విశ్లేషణ (PCA) ప్లాట్లు.
నెమలైన్ మయోపతీలు అస్థిపంజర కండరాలలో MYH-వ్యక్తపరిచే మయోఫైబర్ రకాల నిష్పత్తిని ప్రభావితం చేయగలవు కాబట్టి,19,20 మేము మొదట నెమలైన్ మయోపతీలు ఉన్న రోగులలో మరియు నియంత్రణ సమూహంలో MYH-వ్యక్తపరిచే మయోఫైబర్ రకాలను పరిశీలించాము. మేము 1000 మయోఫైబర్ అస్సే కోసం గతంలో వివరించిన నిష్పక్షపాత పద్ధతిని ఉపయోగించి మయోఫైబర్ రకాన్ని నిర్ధారించాము (సప్లిమెంటరీ చిత్రాలు 10D–E) మరియు మళ్ళీ స్వచ్ఛమైన 2X మయోఫైబర్‌లను గుర్తించడంలో విఫలమయ్యాము (చిత్రం 6B). మయోఫైబర్ రకంపై నెమలైన్ మయోపతీల యొక్క భిన్నమైన ప్రభావాన్ని మేము గమనించాము, ఎందుకంటే ACTA1 మ్యుటేషన్లు ఉన్న ఇద్దరు రోగులలో టైప్ 1 మయోఫైబర్‌ల నిష్పత్తి పెరిగింది, అయితే TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీ ఉన్న ఇద్దరు రోగులలో టైప్ 1 మయోఫైబర్‌ల నిష్పత్తి తగ్గింది (చిత్రం 6B). నిజానికి, ACTA1-నెమలైన్ మయోపతీలలో MYH2 మరియు ఫాస్ట్ ట్రోపోనిన్ ఐసోఫామ్‌ల (TNNC2, TNNI2, మరియు TNNT3) వ్యక్తీకరణ తగ్గింది, అయితే TNNT1-నెమలైన్ మయోపతీలలో MYH7 వ్యక్తీకరణ తగ్గింది (అనుబంధ చిత్రం 11A). ఇది నెమలైన్ మయోపతీలలో భిన్నమైన మయోఫైబర్ రకం మార్పిడికి సంబంధించిన మునుపటి నివేదికలకు అనుగుణంగా ఉంది.19,20 మేము ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ ద్వారా ఈ ఫలితాలను ధృవీకరించాము మరియు ACTA1-నెమలైన్ మయోపతీ ఉన్న రోగులలో టైప్ 1 మయోఫైబర్‌లు అధికంగా ఉన్నాయని, అయితే TNNT1-నెమలైన్ మయోపతీ ఉన్న రోగులలో దీనికి వ్యతిరేక నమూనా ఉందని కనుగొన్నాము (చిత్రం 6A).
సింగిల్-ఫైబర్ ప్రోటియోమ్ స్థాయిలో, ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీ రోగుల నుండి వచ్చిన అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లు చాలా వరకు కంట్రోల్ ఫైబర్‌లతో సమూహంగా ఏర్పడ్డాయి, సాధారణంగా TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీ ఫైబర్‌లు అత్యంత తీవ్రంగా ప్రభావితమయ్యాయి (చిత్రం 6C). ప్రతి రోగికి సూడో-ఇన్‌ఫ్లేటెడ్ ఫైబర్‌ల యొక్క ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ అనాలిసిస్ (PCA) ప్లాట్‌లను గీసినప్పుడు ఇది ప్రత్యేకంగా స్పష్టమైంది, TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీ రోగులు 2 మరియు 3 కంట్రోల్ నమూనాల నుండి అత్యంత దూరంగా కనిపించారు (సప్లిమెంటరీ చిత్రం 11B, సప్లిమెంటరీ డేటా సెట్ 20). మయోపతీ రోగుల ఫైబర్‌లు ఆరోగ్యకరమైన ఫైబర్‌లతో ఎలా పోల్చబడతాయో బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి, మేము ఆరోగ్యకరమైన వయోజన పాల్గొనేవారి నుండి 1,000 ఫైబర్‌ల ప్రోటియోమిక్ విశ్లేషణ నుండి పొందిన వివరణాత్మక సమాచారాన్ని ఉపయోగించాము. మేము మయోపతీ డేటాసెట్ (ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీ రోగులు మరియు కంట్రోల్స్) నుండి ఫైబర్‌లను 1000-ఫైబర్ ప్రోటియోమిక్ విశ్లేషణ నుండి పొందిన PCA ప్లాట్‌పైకి ప్రొజెక్ట్ చేసాము (చిత్రం 6D). నియంత్రణ ఫైబర్‌లలో PC2 వెంబడి MYH ఫైబర్ రకాల పంపిణీ, 1000-ఫైబర్ ప్రోటియోమిక్ విశ్లేషణ నుండి పొందిన ఫైబర్ పంపిణీని పోలి ఉంది. అయితే, నెమలైన్ మయోపతీ రోగులలోని చాలా ఫైబర్‌లు, వాటి సహజ MYH ఫైబర్ రకంతో సంబంధం లేకుండా, PC2 వెంబడి క్రిందికి జరిగి, ఆరోగ్యకరమైన ఫాస్ట్-ట్విచ్ ఫైబర్‌లతో అతివ్యాప్తి చెందాయి. అందువల్ల, MYH-ఆధారిత పద్ధతులను ఉపయోగించి పరిమాణీకరించినప్పుడు ACTA1 నెమలైన్ మయోపతీ ఉన్న రోగులు టైప్ 1 ఫైబర్‌ల వైపు మార్పును చూపినప్పటికీ, ACTA1 నెమలైన్ మయోపతీ మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీ రెండూ అస్థిపంజర కండర ఫైబర్ ప్రోటియోమ్‌ను ఫాస్ట్-ట్విచ్ ఫైబర్‌ల వైపు మార్చాయి.
తరువాత మేము ప్రతి రోగి సమూహాన్ని ఆరోగ్యకరమైన నియంత్రణలతో నేరుగా పోల్చి, ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలలో వరుసగా 256 మరియు 552 విభిన్నంగా వ్యక్తమయ్యే ప్రోటీన్‌లను గుర్తించాము (పటం 6E–G మరియు అనుబంధ పటం 11C, అనుబంధ డేటా సెట్ 21). జన్యు సమృద్ధి విశ్లేషణ మైటోకాండ్రియల్ ప్రోటీన్‌లలో సమన్వయంతో కూడిన తగ్గుదలను వెల్లడించింది (పటం 6H–I, అనుబంధ డేటా సెట్ 22). ఆశ్చర్యకరంగా, ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలలో ఫైబర్ రకాలలో విభిన్న ప్రాబల్యం ఉన్నప్పటికీ, ఈ తగ్గుదల MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకంతో పూర్తిగా సంబంధం లేకుండా ఉంది (పటం 6H మరియు అనుబంధ పటాలు 11D–I, అనుబంధ డేటా సెట్ 23). ACTA1 లేదా TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలలో మూడు మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్‌లు కూడా నియంత్రించబడ్డాయి. ఈ మైక్రోప్రోటీన్‌లలో రెండైన ENSG00000215483_TR14_ORF67 (దీనిని LINC00598 లేదా Lnc-FOXO1 అని కూడా పిలుస్తారు) మరియు ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), టైప్ 1 మయోఫైబర్‌లలో మాత్రమే విభిన్న సమృద్ధిని చూపించాయి. ENSG00000215483_TR14_ORF67 కణ చక్ర నియంత్రణలో పాత్ర పోషిస్తుందని గతంలో నివేదించబడింది. 56 మరోవైపు, ఆరోగ్యకరమైన నియంత్రణలతో పోలిస్తే ACTA1-నెమలైన్ మయోపతీలో టైప్ 1 మరియు టైప్ 2A మయోఫైబర్‌లు రెండింటిలోనూ ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798కు అనుగుణంగా) పెరిగింది (అనుబంధ చిత్రం 12A, అనుబంధ డేటా సెట్ 24). దీనికి విరుద్ధంగా, రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లు నెమలైన్ మయోపతి ద్వారా ఎక్కువగా ప్రభావితం కాలేదు, అయినప్పటికీ ACTA1 నెమలైన్ మయోపతిలో RPS17 డౌన్‌రెగ్యులేట్ చేయబడింది (Fig. 6E).
సమృద్ధి విశ్లేషణలో ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలలో రోగనిరోధక వ్యవస్థ ప్రక్రియల పెరుగుదల వెల్లడైంది, అదే సమయంలో TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలో కణ సంసంజనం కూడా పెరిగింది (పటం 6H). ఈ కణబాహ్య కారకాల సమృద్ధి, కణబాహ్య మాత్రిక ప్రోటీన్లు PC1 మరియు PC2 లలో PCAను ప్రతికూల దిశలో (అంటే, అత్యంత ప్రభావితమైన ఫైబర్‌ల వైపు) మార్చడం ద్వారా ప్రతిబింబించింది (పటం 6J). రెండు రోగి సమూహాలు రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలు మరియు సార్కోలెమ్మల్ మరమ్మత్తు యంత్రాంగాలలో పాల్గొనే కణబాహ్య ప్రోటీన్ల వ్యక్తీకరణను పెంచాయి, ఉదాహరణకు యాన్నెక్సిన్‌లు (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 మరియు వాటితో సంకర్షణ చెందే ప్రోటీన్ S100A1159 (అనుబంధ పటాలు 12B–C). ఈ ప్రక్రియ కండరాల క్షీణతలలో60 వృద్ధి చెందుతుందని గతంలో నివేదించబడింది, కానీ మాకు తెలిసినంతవరకు, ఇది గతంలో నెమలైన్ మయోపతీలతో సంబంధం కలిగి లేదు. గాయం తర్వాత సార్కోలెమ్మల్ మరమ్మత్తు కోసం మరియు కొత్తగా ఏర్పడిన మయోసైట్‌లు మయోఫైబర్‌లతో కలవడానికి ఈ మాలిక్యులర్ యంత్రాంగం యొక్క సాధారణ పనితీరు అవసరం58,61. అందువల్ల, రెండు రోగి సమూహాలలో ఈ ప్రక్రియ యొక్క పెరిగిన కార్యాచరణ, మయోఫైబర్ అస్థిరత వల్ల కలిగే గాయానికి మరమ్మత్తు ప్రతిస్పందనను సూచిస్తుంది.
ప్రతి నెమలైన్ మయోపతీ యొక్క ప్రభావాలు బాగా పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి (r = 0.736) మరియు సహేతుకమైన అతివ్యాప్తిని చూపించాయి (అనుబంధ చిత్రాలు 11A–B), ఇది ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలు ప్రోటీయోమ్‌పై సారూప్య ప్రభావాలను కలిగి ఉన్నాయని సూచిస్తుంది. అయితే, కొన్ని ప్రోటీన్లు ACTA1 లేదా TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలలో మాత్రమే నియంత్రించబడ్డాయి (అనుబంధ చిత్రాలు 11A మరియు C). ప్రోఫైబ్రోటిక్ ప్రోటీన్ MFAP4, TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలో అత్యధికంగా అప్‌రెగ్యులేట్ చేయబడిన ప్రోటీన్లలో ఒకటి, కానీ ACTA1 నెమలైన్ మయోపతీలో మార్పు లేకుండా ఉంది. HOX జన్యు లిప్యంతరీకరణను నియంత్రించడానికి బాధ్యత వహించే PAF1C కాంప్లెక్స్‌లోని ఒక భాగమైన SKIC8, TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలో డౌన్‌రెగ్యులేట్ చేయబడింది కానీ ACTA1 నెమలైన్ మయోపతీలో ప్రభావితం కాలేదు (అనుబంధ చిత్రం 11A). ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలను నేరుగా పోల్చి చూసినప్పుడు, TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలో మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రోటీన్లు ఎక్కువగా తగ్గడం మరియు రోగనిరోధక వ్యవస్థ ప్రోటీన్లు ఎక్కువగా పెరగడం వెల్లడైంది (పటం 6G–H మరియు అనుబంధ పటాలు 11C మరియు 11H–I). ఈ డేటా, ACTA1 నెమలైన్ మయోపతీతో పోలిస్తే ACTA1 నెమలైన్ మయోపతీలో గమనించిన అధిక క్షీణత/డిస్ట్రోఫీకి అనుగుణంగా ఉంది (పటం 6A), ఇది TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీ ఈ వ్యాధి యొక్క మరింత తీవ్రమైన రూపాన్ని సూచిస్తుందని తెలియజేస్తుంది.
నెమలైన్ మయోపతీ యొక్క గమనించిన ప్రభావాలు మొత్తం కండర స్థాయిలో కొనసాగుతాయో లేదో అంచనా వేయడానికి, మేము TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీ రోగుల యొక్క అదే సమూహం నుండి తీసుకున్న కండర బయాప్సీల యొక్క బల్క్ ప్రోటీయోమిక్ విశ్లేషణను నిర్వహించి, వాటిని నియంత్రణ సమూహంతో (ప్రతి సమూహానికి n=3) పోల్చాము (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13A, సప్లిమెంటరీ డేటా సెట్ 25). ఊహించినట్లుగానే, ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ విశ్లేషణలో నియంత్రణ సమూహం దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉంది, అయితే TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీ రోగులు సింగిల్ ఫైబర్ విశ్లేషణలో కనిపించిన విధంగానే అధిక ఇంటర్‌శాంపిల్ వైవిధ్యతను ప్రదర్శించారు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13B). బల్క్ విశ్లేషణ, వ్యక్తిగత ఫైబర్‌లను పోల్చడం ద్వారా హైలైట్ చేయబడిన విభిన్నంగా వ్యక్తమయ్యే ప్రోటీన్‌లను (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13C, సప్లిమెంటరీ డేటా సెట్ 26) మరియు జీవ ప్రక్రియలను (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13D, సప్లిమెంటరీ డేటా సెట్ 27) పునరుత్పత్తి చేసింది, కానీ విభిన్న ఫైబర్ రకాల మధ్య తేడాను గుర్తించే సామర్థ్యాన్ని కోల్పోయింది మరియు ఫైబర్‌ల అంతటా వైవిధ్యభరితమైన వ్యాధి ప్రభావాలను వివరించడంలో విఫలమైంది.
మొత్తంగా చూస్తే, ఇమ్యునోబ్లాటింగ్ వంటి లక్షిత పద్ధతుల ద్వారా గుర్తించలేని క్లినికల్ జీవ లక్షణాలను సింగిల్-మయోఫైబర్ ప్రోటీయోమిక్స్ విశదీకరించగలదని ఈ డేటా నిరూపిస్తుంది. అంతేకాకుండా, ఫినోటైపిక్ అనుసరణను వివరించడానికి కేవలం యాక్టిన్ ఫైబర్ టైపింగ్ (MYH)ను ఉపయోగించడంలో ఉన్న పరిమితులను ఈ డేటా హైలైట్ చేస్తుంది. నిజానికి, యాక్టిన్ మరియు ట్రోపోనిన్ నెమలైన్ మయోపతీల మధ్య ఫైబర్ రకం మారడం భిన్నంగా ఉన్నప్పటికీ, ఈ రెండు నెమలైన్ మయోపతీలు కూడా వేగవంతమైన మరియు తక్కువ ఆక్సీకరణ కండర ప్రోటీయోమ్ వైపుగా, MYH ఫైబర్ టైపింగ్‌ను అస్థిపంజర కండర ఫైబర్ జీవక్రియ నుండి వేరు చేస్తాయి.
కణజాలాలు వాటి విభిన్న అవసరాలను తీర్చడానికి కణ వైవిధ్యం చాలా కీలకం. అస్థిపంజర కండరాలలో, దీనిని తరచుగా వివిధ స్థాయిలలో శక్తిని ఉత్పత్తి చేసే మరియు అలసటను అనుభవించే ఫైబర్ రకాలుగా వర్ణిస్తారు. అయితే, ఇది అస్థిపంజర కండర ఫైబర్ వైవిధ్యంలో కేవలం ఒక చిన్న భాగాన్ని మాత్రమే వివరిస్తుందని స్పష్టమవుతోంది, ఎందుకంటే ఈ వైవిధ్యం గతంలో అనుకున్నదానికంటే చాలా ఎక్కువ వైవిధ్యమైనది, సంక్లిష్టమైనది మరియు బహుముఖమైనది. సాంకేతిక పురోగతులు ఇప్పుడు అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లను నియంత్రించే కారకాలపై వెలుగునిచ్చాయి. నిజానికి, మా డేటా ప్రకారం టైప్ 2X ఫైబర్‌లు ఒక ప్రత్యేకమైన అస్థిపంజర కండర ఫైబర్ ఉపరకం కాకపోవచ్చు. అంతేకాకుండా, జీవక్రియ ప్రోటీన్లు, రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లు మరియు కణ-సంబంధిత ప్రోటీన్లను అస్థిపంజర కండర ఫైబర్ వైవిధ్యానికి ప్రధాన నిర్ణాయకాలుగా మేము గుర్తించాము. నెమటోడ్ మయోపతీ ఉన్న రోగి నమూనాలకు మా ప్రోటీయోమిక్ వర్క్‌ఫ్లోను వర్తింపజేయడం ద్వారా, MYH-ఆధారిత ఫైబర్ టైపింగ్ అస్థిపంజర కండర వైవిధ్యాన్ని పూర్తిగా ప్రతిబింబించదని, ముఖ్యంగా ఈ వ్యవస్థకు అంతరాయం కలిగినప్పుడు, మేము మరింతగా నిరూపించాము. నిజానికి, MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకంతో సంబంధం లేకుండా, నెమటోడ్ మయోపతీ వేగవంతమైన మరియు తక్కువ ఆక్సీకరణ ఫైబర్‌ల వైపు మార్పుకు దారితీస్తుంది.
19వ శతాబ్దం నుండి అస్థిపంజర కండర తంతువులను వర్గీకరిస్తున్నారు. ఇటీవలి ఓమిక్స్ విశ్లేషణలు, వివిధ MYH తంతువుల రకాల వ్యక్తీకరణ తీరులను మరియు వివిధ ఉద్దీపనలకు వాటి ప్రతిస్పందనలను అర్థం చేసుకోవడం ప్రారంభించడానికి మనకు వీలు కల్పించాయి. ఇక్కడ వివరించినట్లుగా, అస్థిపంజర కండర తంతువు రకాన్ని నిర్వచించడానికి ఒకే (లేదా కొన్ని) మార్కర్ల పరిమాణీకరణపై ఆధారపడకుండా, సాంప్రదాయ యాంటీబాడీ-ఆధారిత పద్ధతుల కంటే తంతువు రకం మార్కర్లను పరిమాణీకరించడంలో ఓమిక్స్ విధానాలకు అధిక సున్నితత్వం అనే ప్రయోజనం కూడా ఉంది. మానవ అస్థిపంజర కండర తంతువులలో తంతువుల వైవిధ్యం యొక్క లిప్యంతరీకరణ మరియు లిప్యంతరీకరణానంతర నియంత్రణను పరిశీలించడానికి, మేము పరిపూరక లిప్యంతరీకరణ మరియు ప్రోటీయోమిక్ కార్యప్రవాహాలను ఉపయోగించి, ఫలితాలను ఏకీకృతం చేశాము. ఈ కార్యప్రవాహం ఫలితంగా, మా ఆరోగ్యవంతమైన యువకుల సమూహంలోని వాస్టస్ లేటరాలిస్‌లో ప్రోటీన్ స్థాయిలో స్వచ్ఛమైన 2X-రకం తంతువులను గుర్తించడంలో విఫలమయ్యాము. ఇది గతంలో జరిగిన ఏక తంతువు అధ్యయనాలతో ఏకీభవిస్తుంది, ఆ అధ్యయనాలు ఆరోగ్యవంతమైన వాస్టస్ లేటరాలిస్‌లో <1% స్వచ్ఛమైన 2X తంతువులను కనుగొన్నాయి, అయినప్పటికీ భవిష్యత్తులో ఇతర కండరాలలో దీనిని నిర్ధారించవలసి ఉంది. mRNA స్థాయిలో దాదాపు స్వచ్ఛమైన 2X ఫైబర్‌లను గుర్తించడానికి మరియు ప్రోటీన్ స్థాయిలో కేవలం మిశ్రమ 2A/2X ఫైబర్‌లను గుర్తించడానికి మధ్య ఉన్న వ్యత్యాసం గందరగోళంగా ఉంది. MYH ఐసోఫార్మ్ mRNA వ్యక్తీకరణ సర్కాడియన్ కాదు,67 ఇది RNA స్థాయిలో స్వచ్ఛమైన 2X ఫైబర్‌లలో MYH2 ఆరంభ సంకేతాన్ని మనం "వదిలేసి" ఉండటానికి అవకాశం లేదని సూచిస్తుంది. దీనికి ఒక సంభావ్య వివరణ, పూర్తిగా ఊహాజనితమైనప్పటికీ, MYH ఐసోఫార్మ్‌ల మధ్య ప్రోటీన్ మరియు/లేదా mRNA స్థిరత్వంలో తేడాలు కావచ్చు. నిజానికి, ఏ వేగవంతమైన ఫైబర్ కూడా ఏ MYH ఐసోఫార్మ్‌కు 100% స్వచ్ఛంగా ఉండదు, మరియు 70–90% పరిధిలోని MYH1 mRNA వ్యక్తీకరణ స్థాయిలు ప్రోటీన్ స్థాయిలో సమానమైన MYH1 మరియు MYH2 సమృద్ధికి దారితీస్తాయో లేదో అస్పష్టంగా ఉంది. అయితే, మొత్తం ట్రాన్స్క్రిప్టోమ్ లేదా ప్రోటియోమ్‌ను పరిగణనలోకి తీసుకున్నప్పుడు, క్లస్టర్ విశ్లేషణ వాటి ఖచ్చితమైన MYH కూర్పుతో సంబంధం లేకుండా, నెమ్మదైన మరియు వేగవంతమైన అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లకు ప్రాతినిధ్యం వహించే కేవలం రెండు విభిన్న క్లస్టర్‌లను మాత్రమే విశ్వాసంగా గుర్తించగలదు. ఇది సింగిల్-న్యూక్లియస్ ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ విధానాలను ఉపయోగించి చేసే విశ్లేషణలకు అనుగుణంగా ఉంది, ఇవి సాధారణంగా రెండు విభిన్న మైయోన్యూక్లియర్ క్లస్టర్‌లను మాత్రమే గుర్తిస్తాయి. 68, 69, 70 అంతేకాకుండా, మునుపటి ప్రోటియోమిక్ అధ్యయనాలు టైప్ 2X ఫైబర్‌లను గుర్తించినప్పటికీ, ఈ ఫైబర్‌లు మిగిలిన ఫాస్ట్ ఫైబర్‌ల నుండి విడిగా క్లస్టర్ అవ్వవు మరియు MYH ఆధారంగా ఇతర ఫైబర్ రకాలతో పోలిస్తే తక్కువ సంఖ్యలో విభిన్నంగా సమృద్ధిగా ఉండే ప్రోటీన్‌లను మాత్రమే చూపుతాయి. 14 ఈ ఫలితాలు మనం 20వ శతాబ్దం ప్రారంభంలోని కండర ఫైబర్ వర్గీకరణ దృక్పథానికి తిరిగి వెళ్లాలని సూచిస్తున్నాయి, ఇది మానవ అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లను MYH ఆధారంగా మూడు విభిన్న తరగతులుగా కాకుండా, వాటి జీవక్రియ మరియు సంకోచ లక్షణాల ఆధారంగా రెండు క్లస్టర్‌లుగా విభజించింది. 63
మరీ ముఖ్యంగా, మయోఫైబర్ వైవిధ్యతను బహుముఖ కోణాల్లో పరిగణించాలి. గతంలో జరిగిన “ఓమిక్స్” అధ్యయనాలు ఈ దిశగా సూచించాయి, అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లు వివిక్త సమూహాలను ఏర్పరచవని, కానీ ఒక అవిచ్ఛిన్న శ్రేణిలో అమర్చబడి ఉంటాయని సూచించాయి. 11, 13, 14, 64, 71 ఇక్కడ, అస్థిపంజర కండరాల సంకోచ మరియు జీవక్రియ లక్షణాలలో తేడాలతో పాటు, కణ-కణ పరస్పర చర్యలు మరియు అనువాద యంత్రాంగాలకు సంబంధించిన లక్షణాల ద్వారా కూడా మయోఫైబర్‌లను వేరు చేయవచ్చని మేము చూపిస్తున్నాము. నిజానికి, నెమ్మది మరియు వేగవంతమైన ఫైబర్ రకాలతో సంబంధం లేకుండా వైవిధ్యతకు దోహదపడే రైబోజోమ్ వైవిధ్యతను అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లలో మేము కనుగొన్నాము. నెమ్మది మరియు వేగవంతమైన ఫైబర్ రకంతో సంబంధం లేకుండా, ఈ గణనీయమైన మయోఫైబర్ వైవిధ్యతకు గల మూల కారణం అస్పష్టంగానే ఉంది, కానీ ఇది నిర్దిష్ట శక్తులు మరియు భారాలకు ఉత్తమంగా ప్రతిస్పందించే కండర ఫాసికిల్స్‌లోని ప్రత్యేకమైన ప్రాదేశిక వ్యవస్థను,72 కండర సూక్ష్మ పర్యావరణంలోని ఇతర కణ రకాలతో ప్రత్యేకమైన కణ లేదా అవయవ-నిర్దిష్ట సంభాషణను73,74,75 లేదా వ్యక్తిగత మయోఫైబర్‌లలోని రైబోజోమ్ కార్యకలాపాలలో తేడాలను సూచించవచ్చు. నిజానికి, రైబోసోమల్ హెటెరోప్లాస్మీ, RPL3 మరియు RPL3L యొక్క పారలాగస్ ప్రతిస్థాపన ద్వారా గానీ లేదా rRNA యొక్క 2′O-మిథైలేషన్ స్థాయిలో గానీ, అస్థిపంజర కండరాల హైపర్ట్రోఫీతో సంబంధం కలిగి ఉన్నట్లు చూపబడింది76,77. మల్టీ-ఓమిక్ మరియు స్పేషియల్ అనువర్తనాలు, వ్యక్తిగత మయోఫైబర్‌ల క్రియాత్మక లక్షణాలతో కలిపి, మల్టీ-ఓమిక్ స్థాయిలో కండరాల జీవశాస్త్రంపై మన అవగాహనను మరింతగా ముందుకు తీసుకువెళ్తాయి78.
నెమలైన్ మయోపతీలతో బాధపడుతున్న రోగుల నుండి సేకరించిన ఏక కండర తంతువుల ప్రోటీయోమ్‌లను విశ్లేషించడం ద్వారా, అస్థిపంజర కండరాల క్లినికల్ పాథోఫిజియాలజీని స్పష్టం చేయడానికి ఏక కండర తంతువు ప్రోటీయోమిక్స్ యొక్క ప్రయోజనం, ప్రభావం మరియు అనువర్తనీయతను కూడా మేము ప్రదర్శించాము. అంతేకాకుండా, మా వర్క్‌ఫ్లోను గ్లోబల్ ప్రోటీయోమిక్ విశ్లేషణతో పోల్చడం ద్వారా, ఏక కండర తంతువు ప్రోటీయోమిక్స్, గ్లోబల్ టిష్యూ ప్రోటీయోమిక్స్ వలెనే అదే స్థాయి సమాచారాన్ని అందిస్తుందని మరియు తంతువుల మధ్య వైవిధ్యం మరియు కండర తంతువు రకాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకోవడం ద్వారా ఈ లోతును మరింత విస్తరిస్తుందని మేము ప్రదర్శించగలిగాము. ఆరోగ్యకరమైన నియంత్రణలతో పోలిస్తే ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలలో గమనించిన ఫైబర్ రకం నిష్పత్తిలో ఊహించిన (అయినప్పటికీ వైవిధ్యభరితమైన) వ్యత్యాసాలకు అదనంగా,19 మేము MYH-మధ్యవర్తిత్వ ఫైబర్ రకం మార్పిడితో సంబంధం లేకుండా ఆక్సీకరణ మరియు బాహ్యకణ పునర్నిర్మాణాన్ని కూడా గమనించాము. TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలలో ఫైబ్రోసిస్ గురించి గతంలోనే నివేదించబడింది.19 అయితే, మా విశ్లేషణ ఈ విషయాన్ని మరింత ముందుకు తీసుకువెళ్తూ, ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతీలు ఉన్న రోగుల మయోఫైబర్‌లలో, సార్కోలెమ్మల్ మరమ్మత్తు యంత్రాంగాలలో పాలుపంచుకునే ఆనెక్సిన్‌ల వంటి కణబాహ్యంగా స్రవించే ఒత్తిడి-సంబంధిత ప్రోటీన్‌ల స్థాయిలు పెరిగినట్లు కూడా వెల్లడించింది.57,58,59 ముగింపుగా, నెమలైన్ మయోపతీ ఉన్న రోగుల మయోఫైబర్‌లలో పెరిగిన ఆనెక్సిన్ స్థాయిలు, తీవ్రంగా క్షీణించిన మయోఫైబర్‌లను మరమ్మత్తు చేయడానికి ఒక కణ ప్రతిస్పందనను సూచించవచ్చు.
ఈ అధ్యయనం ఇప్పటి వరకు మానవులపై జరిపిన అతిపెద్ద సింగిల్-ఫైబర్ హోల్-మజిల్-ఓమిక్స్ విశ్లేషణ అయినప్పటికీ, దీనికి కొన్ని పరిమితులు ఉన్నాయి. మేము పాల్గొన్నవారిలో సాపేక్షంగా చిన్న మరియు సజాతీయ నమూనా నుండి మరియు ఒకే కండరం (వాస్టస్ లాటరాలిస్) నుండి అస్థిపంజర కండర ఫైబర్‌లను వేరు చేశాము. అందువల్ల, వివిధ కండర రకాలలో మరియు కండర శరీరధర్మ శాస్త్రం యొక్క తీవ్రస్థాయిలలో నిర్దిష్ట ఫైబర్ సమూహాల ఉనికిని తోసిపుచ్చడం అసాధ్యం. ఉదాహరణకు, అధిక శిక్షణ పొందిన స్ప్రింటర్లు మరియు/లేదా స్ట్రెంగ్త్ అథ్లెట్లలో79 లేదా కండరాల నిష్క్రియాత్మకత కాలంలో66,80 అల్ట్రాఫాస్ట్ ఫైబర్‌ల ఉపసమితి (ఉదాహరణకు, స్వచ్ఛమైన 2X ఫైబర్‌లు) ఉద్భవించే అవకాశాన్ని మేము తోసిపుచ్చలేము. అంతేకాకుండా, పాల్గొన్నవారి పరిమిత నమూనా పరిమాణం ఫైబర్ వైవిధ్యంలో లింగ భేదాలను పరిశోధించకుండా మమ్మల్ని నిరోధించింది, ఎందుకంటే పురుషులు మరియు మహిళల మధ్య ఫైబర్ రకాల నిష్పత్తులు భిన్నంగా ఉంటాయని తెలిసిన విషయమే. ఇంకా, మేము ఒకే కండర ఫైబర్‌లపై లేదా ఒకే పాల్గొన్నవారి నుండి వచ్చిన నమూనాలపై ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటియోమిక్ విశ్లేషణలను నిర్వహించలేకపోయాము. మేము మరియు ఇతరులు ఓమిక్స్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి సింగిల్-సెల్ మరియు సింగిల్-మయోఫైబర్ విశ్లేషణలను ఆప్టిమైజ్ చేస్తూ, అతి తక్కువ నమూనా వినియోగాన్ని సాధిస్తున్నందున (మైటోకాన్డ్రియల్ మయోపతీ ఉన్న రోగుల ఫైబర్‌ల విశ్లేషణలో ఇక్కడ చూపినట్లుగా), ఒకే కండర ఫైబర్‌లలో మల్టీ-ఓమిక్స్ (మరియు ఫంక్షనల్) విధానాలను మిళితం చేసే అవకాశం స్పష్టమవుతోంది.
మొత్తం మీద, మా డేటా అస్థిపంజర కండరాల వైవిధ్యానికి కారణమయ్యే ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ మరియు పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ అంశాలను గుర్తించి, వివరిస్తుంది. ప్రత్యేకంగా, ఫైబర్ రకాల యొక్క సాంప్రదాయ MYH-ఆధారిత నిర్వచనంతో ముడిపడి ఉన్న అస్థిపంజర కండరాల శరీరధర్మశాస్త్రంలోని ఒక దీర్ఘకాలిక సిద్ధాంతాన్ని సవాలు చేసే డేటాను మేము అందిస్తున్నాము. ఈ చర్చను పునరుద్ధరించి, అంతిమంగా అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ వర్గీకరణ మరియు వైవిధ్యంపై మన అవగాహనను పునరాలోచించాలని మేము ఆశిస్తున్నాము.
పద్నాలుగు మంది కాకేసియన్ పాల్గొనేవారు (12 మంది పురుషులు మరియు 2 మంది మహిళలు) ఈ అధ్యయనంలో పాల్గొనడానికి స్వచ్ఛందంగా అంగీకరించారు. ఈ అధ్యయనం ఘెంట్ యూనివర్సిటీ హాస్పిటల్ యొక్క ఎథిక్స్ కమిటీ (BC-10237)చే ఆమోదించబడింది, 2013 హెల్సింకి డిక్లరేషన్‌కు అనుగుణంగా ఉంది మరియు ClinicalTrials.gov (NCT05131555)లో నమోదు చేయబడింది. పాల్గొనేవారి సాధారణ లక్షణాలు అనుబంధ పట్టిక 1లో ప్రదర్శించబడ్డాయి. మౌఖిక మరియు లిఖితపూర్వక సమాచార సమ్మతిని పొందిన తర్వాత, అధ్యయనంలో తుది చేరికకు ముందు పాల్గొనేవారు వైద్య పరీక్ష చేయించుకున్నారు. పాల్గొనేవారు యువకులు (22–42 సంవత్సరాలు), ఆరోగ్యవంతులు (ఎటువంటి వైద్య పరిస్థితులు లేవు, ధూమపానం చేసే చరిత్ర లేదు), మరియు మితంగా శారీరకంగా చురుకుగా ఉండేవారు. ఇంతకు ముందు వివరించిన విధంగా శారీరక దృఢత్వాన్ని అంచనా వేయడానికి స్టెప్ ఎర్గోమీటర్‌ను ఉపయోగించి గరిష్ట ఆక్సిజన్ వినియోగాన్ని నిర్ణయించారు. 81
కండరాల బయాప్సీ నమూనాలను విశ్రాంతి మరియు ఉపవాస స్థితిలో మూడుసార్లు, 14 రోజుల వ్యవధిలో సేకరించారు. ఈ నమూనాలను ఒక పెద్ద అధ్యయనంలో భాగంగా సేకరించినందున, పాల్గొన్నవారు బయాప్సీకి 40 నిమిషాల ముందు ప్లేసిబో (లాక్టోస్), ఒక H1-రిసెప్టర్ యాంటాగోనిస్ట్ (540 mg ఫెక్సోఫెనాడిన్), లేదా ఒక H2-రిసెప్టర్ యాంటాగోనిస్ట్ (40 mg ఫామోటిడిన్) తీసుకున్నారు. ఈ హిస్టమైన్ రిసెప్టర్ యాంటాగోనిస్ట్‌లు విశ్రాంతి స్థితిలో ఉన్న అస్థిపంజర కండరాల ఫిట్‌నెస్‌ను ప్రభావితం చేయవని మేము గతంలో నిరూపించాము81, మరియు మా క్వాలిటీ కంట్రోల్ ప్లాట్‌లలో (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్స్ 3 మరియు 6) స్థితికి సంబంధించిన క్లస్టరింగ్ ఏదీ గమనించబడలేదు. ప్రతి ప్రయోగ దినానికి 48 గంటల ముందు ఒక ప్రామాణిక ఆహారం (41.4 kcal/kg శరీర బరువు, 5.1 g/kg శరీర బరువు కార్బోహైడ్రేట్, 1.4 g/kg శరీర బరువు ప్రోటీన్, మరియు 1.6 g/kg శరీర బరువు కొవ్వు) పాటించబడింది, మరియు ప్రయోగ దినం ఉదయం ఒక ప్రామాణిక అల్పాహారం (1.5 g/kg శరీర బరువు కార్బోహైడ్రేట్) తీసుకోబడింది. స్థానిక అనస్థీషియా (ఎపినెఫ్రిన్ లేని 0.5 మి.లీ 1% లిడోకైన్) కింద, పెర్క్యుటేనియస్ బెర్గ్‌స్ట్రామ్ ఆస్పిరేషన్ ఉపయోగించి వాస్టస్ లేటరాలిస్ కండరం నుండి కండర బయాప్సీలను పొందారు.82 కండర నమూనాలను వెంటనే RNAlaterలో పొందుపరిచి, మాన్యువల్ ఫైబర్ విచ్ఛేదనం (3 రోజుల వరకు) వరకు 4°C వద్ద నిల్వ చేశారు.
తాజాగా వేరు చేసిన మయోఫైబర్ కట్టలను ఒక కల్చర్ డిష్‌లోని తాజా RNAlater మాధ్యమంలోకి బదిలీ చేశారు. ఆ తర్వాత, ఒక స్టీరియోమైక్రోస్కోప్ మరియు సన్నని ట్వీజర్లను ఉపయోగించి ప్రతి మయోఫైబర్‌ను చేతితో విడదీశారు. బయాప్సీలోని వివిధ ప్రాంతాల నుండి ఫైబర్‌లను ఎంచుకోవడంపై ప్రత్యేక శ్రద్ధ వహిస్తూ, ప్రతి బయాప్సీ నుండి ఇరవై ఐదు ఫైబర్‌లను విడదీశారు. విడదీసిన తర్వాత, అవాంఛిత ప్రోటీన్లు మరియు DNAను తొలగించడానికి, ప్రతి ఫైబర్‌ను ప్రోటీనేస్ K మరియు DNase ఎంజైమ్‌లను కలిగి ఉన్న 3 μl లైసిస్ బఫర్ (సింగిల్‌షాట్ సెల్ లైసిస్ కిట్, బయో-రాడ్)లో సున్నితంగా ముంచారు. ఆ తర్వాత, క్లుప్తంగా వోర్టెక్సింగ్ చేయడం, మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్‌లో ద్రవాన్ని తిప్పడం, మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద (10 నిమిషాలు) ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా కణ విచ్ఛిన్నం మరియు ప్రోటీన్/DNA తొలగింపును ప్రారంభించారు. ఆ తర్వాత లైసేట్‌ను థర్మల్ సైక్లర్ (T100, బయో-రాడ్)లో 37°C వద్ద 5 నిమిషాలు, 75°C వద్ద 5 నిమిషాలు ఇంక్యుబేట్ చేసి, తదుపరి ప్రాసెసింగ్ వరకు వెంటనే -80°C వద్ద నిల్వ చేశారు.
క్వాంట్‌సీక్-పూల్ 3′ mRNA-Seq లైబ్రరీ ప్రిపరేషన్ కిట్ (లెక్సోజెన్) ఉపయోగించి, 2 µl మయోఫైబర్ లైసేట్ నుండి ఇల్యూమినా-అనుకూల పాలియాడెనిలేటెడ్ RNA లైబ్రరీలను తయారు చేశారు. వివరణాత్మక పద్ధతులను తయారీదారు మాన్యువల్‌లో చూడవచ్చు. ఈ ప్రక్రియ రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ద్వారా ఫస్ట్-స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణతో ప్రారంభమవుతుంది, ఈ సమయంలో నమూనాలను పూల్ చేయడాన్ని నిర్ధారించడానికి మరియు తదుపరి ప్రాసెసింగ్ సమయంలో సాంకేతిక వైవిధ్యాన్ని తగ్గించడానికి ప్రత్యేకమైన మాలిక్యులర్ ఐడెంటిఫైయర్‌లు (UMIలు) మరియు నమూనా-నిర్దిష్ట i1 బార్‌కోడ్‌లు ప్రవేశపెట్టబడతాయి. ఆ తర్వాత 96 మయోఫైబర్‌ల నుండి వచ్చిన cDNAను పూల్ చేసి, మాగ్నెటిక్ బీడ్స్‌తో శుద్ధి చేస్తారు, అనంతరం RNAను తొలగించి, రాండమ్ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి సెకండ్-స్ట్రాండ్ సంశ్లేషణ నిర్వహిస్తారు. లైబ్రరీని మాగ్నెటిక్ బీడ్స్‌తో శుద్ధి చేసి, పూల్-నిర్దిష్ట i5/i7 ట్యాగ్‌లను జోడించి, PCR ద్వారా విస్తరిస్తారు. చివరి శుద్ధీకరణ దశ ఇల్యూమినా-అనుకూల లైబ్రరీలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది. ప్రతి లైబ్రరీ పూల్ యొక్క నాణ్యతను హై సెన్సిటివిటీ స్మాల్ ఫ్రాగ్మెంట్ DNA అనాలిసిస్ కిట్ (అజిలెంట్ టెక్నాలజీస్, DNF-477-0500) ఉపయోగించి అంచనా వేశారు.
క్యూబిట్ క్వాంటిఫికేషన్ ఆధారంగా, పూల్స్‌ను సమమోలార్ గాఢతలలో (2 nM) మరింతగా పూల్ చేశారు. ఫలితంగా వచ్చిన పూల్‌ను, నోవాసీక్ S2 రిఏజెంట్ కిట్ (1 × 100 న్యూక్లియోటైడ్లు) మరియు 2 nM లోడింగ్ (4% PhiX) ఉపయోగించి, స్టాండర్డ్ మోడ్‌లో నోవాసీక్ 6000 పరికరంలో సీక్వెన్స్ చేశారు.
మా పైప్‌లైన్ లెక్సోజెన్ యొక్క క్వాంట్‌సీక్ పూల్ డేటా విశ్లేషణ పైప్‌లైన్ (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) పై ఆధారపడి ఉంది. డేటాను మొదట i7/i5 ఇండెక్స్ ఆధారంగా bcl2fastq2 (v2.20.0) తో డీమల్టీప్లెక్స్ చేశారు. ఆ తర్వాత రీడ్ 2ను i1 శాంపిల్ బార్‌కోడ్ ఆధారంగా idemux (v0.1.6) తో డీమల్టీప్లెక్స్ చేసి, umi_tools (v1.0.1) తో UMI సీక్వెన్సులను సంగ్రహించారు. ఆ తర్వాత చిన్న రీడ్‌లను (<20 పొడవు) లేదా కేవలం అడాప్టర్ సీక్వెన్సులను మాత్రమే కలిగి ఉన్న రీడ్‌లను తొలగించడానికి, రీడ్‌లను cutadapt (v3.4) తో పలు దఫాలుగా ట్రిమ్ చేశారు. ఆ తర్వాత రీడ్‌లను STAR (v2.6.0c) ఉపయోగించి మానవ జన్యువుకు అలైన్ చేసి, BAM ఫైల్‌లను SAMtools (v1.11) తో ఇండెక్స్ చేశారు. డూప్లికేట్ రీడ్‌లను umi_tools (v1.0.1) ఉపయోగించి తొలగించారు. చివరగా, సబ్‌రీడ్ (v2.0.3)లోని ఫీచర్‌కౌంట్స్ ఉపయోగించి అలైన్‌మెంట్ లెక్కింపు జరిగింది. పైప్‌లైన్‌లోని అనేక మధ్యంతర దశలలో ఫాస్ట్‌క్యూసి (v0.11.9) ఉపయోగించి నాణ్యత నియంత్రణ జరిగింది.
తదుపరి బయోఇన్ఫర్మాటిక్స్ ప్రాసెసింగ్ మరియు విజువలైజేషన్ అన్నీ R (v4.2.3) లో, ప్రధానంగా సీరట్ (v4.4.0) వర్క్‌ఫ్లోను ఉపయోగించి నిర్వహించబడ్డాయి. 83 అందువల్ల, వ్యక్తిగత UMI విలువలు మరియు మెటాడేటా మాత్రికలు సీరట్ ఆబ్జెక్ట్‌లుగా మార్చబడ్డాయి. అన్ని ఫైబర్‌లలో 30% కంటే తక్కువగా వ్యక్తమయ్యే జన్యువులు తొలగించబడ్డాయి. 1000 UMI విలువలు మరియు 1000 గుర్తించబడిన జన్యువుల కనీస పరిమితి ఆధారంగా తక్కువ-నాణ్యత నమూనాలు తొలగించబడ్డాయి. చివరికి, 925 ఫైబర్‌లు అన్ని నాణ్యత నియంత్రణ ఫిల్టరింగ్ దశలను దాటాయి. UMI విలువలు సీరట్ SCTransform v2 పద్ధతిని ఉపయోగించి సాధారణీకరించబడ్డాయి, 84 ఇందులో గుర్తించబడిన మొత్తం 7418 ఫీచర్‌లు ఉన్నాయి, మరియు పాల్గొనేవారి మధ్య తేడాలు రిగ్రెస్ చేయబడ్డాయి. సంబంధిత మెటాడేటా అంతా సప్లిమెంటరీ డేటాసెట్ 28లో చూడవచ్చు.