మైయోసిన్ భారీ గొలుసుకు ఆవల మానవ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల యొక్క వైవిధ్యత

nature.com ని సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు ఉపయోగిస్తున్న బ్రౌజర్ వెర్షన్ పరిమిత CSS మద్దతును కలిగి ఉంది. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, తాజా బ్రౌజర్ వెర్షన్‌ను ఉపయోగించమని మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో అనుకూలత మోడ్‌ను నిలిపివేయడం). అదనంగా, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, ఈ సైట్ శైలులు మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా ఉంటుంది.
అస్థిపంజర కండరం అనేది ప్రధానంగా మైయోఫిబ్రిల్స్‌తో కూడిన వైవిధ్య కణజాలం, ఇది మానవులలో సాధారణంగా మూడు రకాలుగా వర్గీకరించబడుతుంది: ఒకటి "నెమ్మదిగా" (రకం 1) మరియు రెండు "వేగవంతమైన" (రకాలు 2A మరియు 2X). అయితే, సాంప్రదాయ మైయోఫిబ్రిల్ రకాల మధ్య మరియు లోపల వైవిధ్యత సరిగా అర్థం కాలేదు. మేము వరుసగా హ్యూమన్ వాస్టస్ లాటరాలిస్ నుండి 1050 మరియు 1038 వ్యక్తిగత మైయోఫిబ్రిల్స్‌కు ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటీమిక్ విధానాలను వర్తింపజేసాము. ప్రోటీమిక్ అధ్యయనంలో పురుషులు ఉన్నారు మరియు ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ అధ్యయనంలో 10 మంది పురుషులు మరియు 2 మంది మహిళలు ఉన్నారు. మైయోసిన్ హెవీ చైన్ ఐసోఫామ్‌లతో పాటు, జీవక్రియ ప్రోటీన్లు, రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లు మరియు సెల్యులార్ జంక్షనల్ ప్రోటీన్‌లను బహుళ డైమెన్షనల్ ఇంటర్‌మైయోఫిబ్రిల్ వైవిధ్యానికి మూలాలుగా గుర్తించాము. ఇంకా, నెమ్మదిగా మరియు వేగంగా ఉండే ఫైబర్‌ల సమూహాలను గుర్తించినప్పటికీ, టైప్ 2X ఫైబర్‌లు ఇతర ఫాస్ట్-ట్విచ్ ఫైబర్‌ల నుండి ఫినోటైపికల్‌గా వేరు చేయలేవని మా డేటా సూచిస్తుంది. ఇంకా, నెమలిన్ మయోపతిలలో మైయోఫైబర్ ఫినోటైప్‌ను వివరించడానికి మైయోసిన్ హెవీ చైన్-ఆధారిత వర్గీకరణ సరిపోదు. మొత్తంమీద, మా డేటా బహుమితీయ మైయోఫైబర్ వైవిధ్యతను సూచిస్తుంది, వైవిధ్య మూలాలు మైయోసిన్ హెవీ చైన్ ఐసోఫామ్‌లకు మించి విస్తరించి ఉన్నాయి.
సెల్యులార్ వైవిధ్యత అనేది అన్ని జీవ వ్యవస్థల యొక్క స్వాభావిక లక్షణం, ఇది కణాలు కణజాలం మరియు కణాల యొక్క విభిన్న అవసరాలను తీర్చడానికి ప్రత్యేకత పొందేందుకు వీలు కల్పిస్తుంది.1 అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ వైవిధ్యత యొక్క సాంప్రదాయ దృక్పథం ఏమిటంటే, మోటారు న్యూరాన్లు మోటారు యూనిట్‌లోని ఫైబర్ రకాన్ని నిర్వచిస్తాయి మరియు ఫైబర్ రకం (అంటే, మానవులలో టైప్ 1, టైప్ 2A, మరియు టైప్ 2X) మైయోసిన్ హెవీ చైన్ (MYH) ఐసోఫామ్‌ల లక్షణాల ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది.2 ఇది మొదట్లో వాటి pH ATPase అస్థిరతపై ఆధారపడి ఉంటుంది,3,4 మరియు తరువాత వాటి MYH యొక్క పరమాణు వ్యక్తీకరణపై ఆధారపడి ఉంటుంది.5 అయితే, విభిన్న నిష్పత్తులలో బహుళ MYHలను సహ-వ్యక్తీకరించే "మిశ్రమ" ఫైబర్‌లను గుర్తించడం మరియు తదుపరి అంగీకారంతో, అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లను విభిన్న ఫైబర్ రకాలుగా కాకుండా నిరంతరాయంగా ఎక్కువగా చూస్తారు.6 అయినప్పటికీ, ఈ క్షేత్రం ఇప్పటికీ మైయోఫైబర్ వర్గీకరణకు ప్రాథమిక వర్గీకరణగా MYHపై ఎక్కువగా ఆధారపడుతుంది, ప్రారంభ ఎలుకల అధ్యయనాల పరిమితులు మరియు ముఖ్యమైన పక్షపాతాల ద్వారా ప్రభావితమయ్యే అవకాశం ఉంది, దీని MYH వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌లు మరియు ఫైబర్ రకాల పరిధి మానవులలో వాటి నుండి భిన్నంగా ఉంటుంది.2 వివిధ మానవ అస్థిపంజర కండరాలు ప్రదర్శించడం ద్వారా పరిస్థితి మరింత క్లిష్టంగా ఉంటుంది ఫైబర్ రకాల వైవిధ్యం.7 వాస్టస్ లాటరాలిస్ అనేది ఇంటర్మీడియట్ (మరియు అందువల్ల ప్రతినిధి) MYH వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌తో కూడిన మిశ్రమ కండరం.7 ఇంకా, దాని నమూనా సౌలభ్యం దీనిని మానవులలో ఉత్తమంగా అధ్యయనం చేయబడిన కండరంగా చేస్తుంది.
అందువల్ల, శక్తివంతమైన "ఓమిక్స్" సాధనాలను ఉపయోగించి అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ వైవిధ్యం యొక్క నిష్పాక్షిక పరిశోధన చాలా ముఖ్యమైనది కానీ సవాలుతో కూడుకున్నది, దీనికి కారణం అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల యొక్క బహుళ కేంద్రక స్వభావం. అయితే, ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్స్8,9 మరియు ప్రోటీమిక్స్10 సాంకేతికతలు ఇటీవలి సంవత్సరాలలో వివిధ సాంకేతిక పురోగతుల కారణంగా సున్నితత్వంలో విప్లవాన్ని చవిచూశాయి, ఇది సింగిల్-ఫైబర్ రిజల్యూషన్‌లో అస్థిపంజర కండరాల విశ్లేషణను అనుమతిస్తుంది. ఫలితంగా, సింగిల్-ఫైబర్ వైవిధ్యాన్ని మరియు అట్రోఫిక్ ఉద్దీపనలకు మరియు వృద్ధాప్యానికి వాటి ప్రతిస్పందనను వర్గీకరించడంలో గణనీయమైన పురోగతి సాధించబడింది11,12,13,14,15,16,17,18. ముఖ్యంగా, ఈ సాంకేతిక పురోగతులు క్లినికల్ అప్లికేషన్‌లను కలిగి ఉంటాయి, ఇది వ్యాధి-సంబంధిత డైస్రెగ్యులేషన్ యొక్క మరింత వివరణాత్మక మరియు ఖచ్చితమైన లక్షణాలను అనుమతిస్తుంది. ఉదాహరణకు, అత్యంత సాధారణ వారసత్వ కండరాల వ్యాధులలో ఒకటైన నెమలిన్ మయోపతి యొక్క పాథోఫిజియాలజీ (MIM 605355 మరియు MIM 161800) సంక్లిష్టమైనది మరియు గందరగోళంగా ఉంటుంది. 19,20 అందువల్ల, అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల యొక్క డైస్రెగ్యులేషన్ యొక్క మెరుగైన లక్షణం ఈ వ్యాధి గురించి మన అవగాహనలో గణనీయమైన పురోగతికి దారితీస్తుంది.
మానవ బయాప్సీ నమూనాల నుండి మానవీయంగా వేరుచేయబడిన సింగిల్ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల యొక్క ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటీయోమిక్ విశ్లేషణ కోసం మేము పద్ధతులను అభివృద్ధి చేసాము మరియు వాటిని వేలాది ఫైబర్‌లకు వర్తింపజేసాము, దీని వలన మానవ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల సెల్యులార్ వైవిధ్యతను పరిశోధించడానికి మాకు వీలు కలిగింది. ఈ పనిలో, కండరాల ఫైబర్‌ల యొక్క ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటీయోమిక్ ఫినోటైపింగ్ యొక్క శక్తిని మేము ప్రదర్శించాము మరియు జీవక్రియ, రైబోసోమల్ మరియు సెల్యులార్ జంక్షనల్ ప్రోటీన్‌లను ఇంటర్‌ఫైబర్ వేరియబిలిటీ యొక్క ముఖ్యమైన వనరులు అని గుర్తించాము. ఇంకా, ఈ ప్రోటీమిక్ వర్క్‌ఫ్లో ఉపయోగించి, సింగిల్ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో నెమటోడ్ మయోపతి యొక్క క్లినికల్ ఔచిత్యాన్ని మేము వర్గీకరించాము, MYH ఆధారంగా ఫైబర్ రకం నుండి స్వతంత్రంగా ఆక్సీకరణం చెందని ఫైబర్‌ల వైపు సమన్వయ మార్పును వెల్లడిస్తాము.
మానవ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల వైవిధ్యతను పరిశోధించడానికి, సింగిల్ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల యొక్క ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ మరియు ప్రోటీమ్ విశ్లేషణను ప్రారంభించడానికి మేము రెండు వర్క్‌ఫ్లోలను అభివృద్ధి చేసాము (మూర్తి 1A మరియు అనుబంధ చిత్రం 1A). నమూనా నిల్వ మరియు RNA మరియు ప్రోటీన్ సమగ్రత యొక్క సంరక్షణ నుండి ప్రతి విధానానికి త్రూపుట్‌ను ఆప్టిమైజ్ చేయడం వరకు మేము అనేక పద్దతి దశలను అభివృద్ధి చేసి ఆప్టిమైజ్ చేసాము. ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ విశ్లేషణ కోసం, రివర్స్ ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ యొక్క ప్రారంభ దశలో నమూనా-నిర్దిష్ట మాలిక్యులర్ బార్‌కోడ్‌లను చొప్పించడం ద్వారా ఇది సాధించబడింది, ఇది సమర్థవంతమైన డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రాసెసింగ్ కోసం 96 ఫైబర్‌లను పూల్ చేయడానికి వీలు కల్పిస్తుంది. సాంప్రదాయ సింగిల్-సెల్ విధానాలతో పోలిస్తే లోతైన సీక్వెన్సింగ్ (ఫైబర్‌కు ±1 మిలియన్ రీడ్‌లు) ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ డేటాను మరింత సుసంపన్నం చేసింది. 21 ప్రోటీమిక్స్ కోసం, అధిక నిర్గమాంశను కొనసాగిస్తూ ప్రోటీమ్ లోతును ఆప్టిమైజ్ చేయడానికి మేము టిమ్స్‌టోఫ్ మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌లో DIA-PASEF డేటా సముపార్జనతో కలిపి ఒక చిన్న క్రోమాటోగ్రాఫిక్ ప్రవణతను (21 నిమిషాలు) ఉపయోగించాము. 22,23 ఆరోగ్యకరమైన అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల వైవిధ్యతను పరిశోధించడానికి, మేము 14 ఆరోగ్యకరమైన వయోజన దాతల నుండి 1,050 వ్యక్తిగత ఫైబర్‌ల ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్‌లను మరియు 5 ఆరోగ్యకరమైన వయోజన దాతల నుండి 1,038 ఫైబర్‌ల ప్రోటీమ్‌లను వర్గీకరించాము (అనుబంధ పట్టిక 1). ఈ పత్రంలో, ఈ డేటాసెట్‌లను వరుసగా 1,000-ఫైబర్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్‌లు మరియు ప్రోటీమ్‌లుగా సూచిస్తారు. మా విధానం 1,000-ఫైబర్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణలలో మొత్తం 27,237 ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు 2,983 ప్రోటీన్‌లను గుర్తించింది (మూర్తి 1A, అనుబంధ డేటాసెట్‌లు 1–2). >1,000 గుర్తించబడిన జన్యువులు మరియు ఫైబర్‌కు 50% చెల్లుబాటు అయ్యే విలువల కోసం ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటీమిక్ డేటాసెట్‌లను ఫిల్టర్ చేసిన తర్వాత, ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ మరియు ప్రోటీమ్‌లోని 925 మరియు 974 ఫైబర్‌లకు తదుపరి బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ విశ్లేషణలు నిర్వహించబడ్డాయి. వడపోత తర్వాత, ప్రతి ఫైబర్‌కు సగటున 4257 ± 1557 జన్యువులు మరియు 2015 ± 234 ప్రోటీన్లు (సగటు ± SD) కనుగొనబడ్డాయి, పరిమితమైన అంతర్-వ్యక్తిగత వైవిధ్యంతో (అనుబంధ గణాంకాలు 1B–C, అనుబంధ డేటాసెట్‌లు 3–4). అయితే, పాల్గొనేవారిలో విషయ-లోపల వైవిధ్యం ఎక్కువగా కనిపించింది, బహుశా వివిధ పొడవులు మరియు క్రాస్-సెక్షనల్ ప్రాంతాల ఫైబర్‌ల మధ్య RNA/ప్రోటీన్ దిగుబడిలో తేడాల కారణంగా. చాలా ప్రోటీన్‌లకు (>2000), వైవిధ్య గుణకం 20% కంటే తక్కువగా ఉంది (అనుబంధ చిత్రణ 1D). రెండు పద్ధతులు కండరాల సంకోచానికి ముఖ్యమైన అధిక వ్యక్తీకరణ సంతకాలతో విస్తృత డైనమిక్ శ్రేణి ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌లను సంగ్రహించడానికి అనుమతించాయి (ఉదా., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (అనుబంధ గణాంకాలు 1E–F). గుర్తించబడిన చాలా లక్షణాలు ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటీమిక్ డేటాసెట్ల మధ్య సాధారణం (అనుబంధ చిత్రం 1G), మరియు ఈ లక్షణాల సగటు UMI/LFQ తీవ్రతలు సహేతుకంగా బాగా పరస్పర సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి (r = 0.52) (అనుబంధ చిత్రం 1H).
ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు ప్రోటీమిక్స్ వర్క్‌ఫ్లో (BioRender.com తో సృష్టించబడింది). BD MYH7, MYH2 మరియు MYH1 కోసం డైనమిక్ రేంజ్ వక్రతలు మరియు ఫైబర్ రకం అసైన్‌మెంట్ కోసం లెక్కించిన థ్రెషోల్డ్‌లు. E, F ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు ప్రోటీమిక్స్ డేటాసెట్‌లలో ఫైబర్‌లలో MYH వ్యక్తీకరణ పంపిణీ. G, H MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకం ద్వారా రంగు వేయబడిన ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు ప్రోటీమిక్స్ కోసం యూనిఫాం డైవర్సిటీ అప్రోక్సిమేషన్ అండ్ ప్రొజెక్షన్ (UMAP) ప్లాట్లు. ట్రాన్స్క్రిప్టోమిక్స్ మరియు ప్రోటీమిక్స్ డేటాసెట్‌లలో MYH7, MYH2 మరియు MYH1 వ్యక్తీకరణను చూపించే I, J ఫీచర్ ప్లాట్లు.
మేము మొదట్లో ప్రతి ఫైబర్‌కు MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకాన్ని కేటాయించడానికి బయలుదేరాము, ఇది ఓమిక్స్ డేటాసెట్‌లలో MYH వ్యక్తీకరణ యొక్క అధిక సున్నితత్వం మరియు డైనమిక్ పరిధిని సద్వినియోగం చేసుకునే ఆప్టిమైజ్ చేసిన విధానాన్ని ఉపయోగిస్తుంది. మునుపటి అధ్యయనాలు ఫైబర్‌లను స్వచ్ఛమైన రకం 1, రకం 2A, రకం 2X లేదా విభిన్న MYHల యొక్క స్థిర శాతం వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా మిశ్రమంగా లేబుల్ చేయడానికి ఏకపక్ష థ్రెషోల్డ్‌లను ఉపయోగించాయి11,14,24. మేము ఫైబర్‌లను టైప్ చేయడానికి ఉపయోగించిన MYHల ద్వారా ప్రతి ఫైబర్ యొక్క వ్యక్తీకరణను ర్యాంక్ చేసిన విభిన్న విధానాన్ని ఉపయోగించాము: MYH7, MYH2 మరియు MYH1, వరుసగా టైప్ 1, రకం 2A మరియు టైప్ 2X ఫైబర్‌లకు అనుగుణంగా ఉంటాయి. అప్పుడు మేము గణితశాస్త్రంలో ప్రతి ఫలిత వక్రత యొక్క దిగువ ఇన్‌ఫ్లెక్షన్ పాయింట్‌ను లెక్కించాము మరియు ప్రతి MYHకి పాజిటివ్ (థ్రెషోల్డ్ పైన) లేదా నెగటివ్ (థ్రెషోల్డ్ క్రింద) ఫైబర్‌లను కేటాయించడానికి దానిని థ్రెషోల్డ్‌గా ఉపయోగించాము (మూర్తి 1B–D). ఈ డేటా MYH7 (Figure 1B) మరియు MYH2 (Figure 1C) ప్రోటీన్ స్థాయితో పోలిస్తే RNA స్థాయిలో మరింత విభిన్నమైన ఆన్/ఆఫ్ ఎక్స్‌ప్రెషన్ ప్రొఫైల్‌లను కలిగి ఉన్నాయని నిరూపిస్తుంది. నిజానికి, ప్రోటీన్ స్థాయిలో, చాలా తక్కువ ఫైబర్‌లు MYH7ని వ్యక్తపరచలేదు మరియు ఏ ఫైబర్ 100% MYH2 ఎక్స్‌ప్రెషన్‌ను కలిగి లేదు. ప్రతి డేటాసెట్‌లోని అన్ని ఫైబర్‌లకు MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకాలను కేటాయించడానికి మేము తరువాత ముందుగా నిర్ణయించిన ఎక్స్‌ప్రెషన్ థ్రెషోల్డ్‌లను ఉపయోగించాము. ఉదాహరణకు, MYH7+/MYH2-/MYH1- ఫైబర్‌లను టైప్ 1కి కేటాయించగా, MYH7-/MYH2+/MYH1+ ఫైబర్‌లను మిశ్రమ రకం 2A/2Xకి కేటాయించారు (పూర్తి వివరణ కోసం అనుబంధ పట్టిక 2 చూడండి). అన్ని ఫైబర్‌లను పూల్ చేస్తూ, RNA (Figure 1E) మరియు ప్రోటీన్ (Figure 1F) స్థాయిలలో MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకాల యొక్క అసాధారణమైన సారూప్య పంపిణీని మేము గమనించాము, అయితే MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకాల సాపేక్ష కూర్పు వ్యక్తులలో ఊహించిన విధంగా మారుతూ ఉంటుంది (అనుబంధ చిత్రం 2A). చాలా ఫైబర్‌లను స్వచ్ఛమైన రకం 1 (34–35%) లేదా రకం 2A (36–38%)గా వర్గీకరించారు, అయితే గణనీయమైన సంఖ్యలో మిశ్రమ రకం 2A/2X ఫైబర్‌లు కూడా కనుగొనబడ్డాయి (16–19%). ఒక ముఖ్యమైన తేడా ఏమిటంటే స్వచ్ఛమైన రకం 2X ఫైబర్‌లను RNA స్థాయిలో మాత్రమే గుర్తించవచ్చు, కానీ ప్రోటీన్ స్థాయిలో కాదు, వేగవంతమైన MYH వ్యక్తీకరణ కనీసం పాక్షికంగా పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రకారం నియంత్రించబడుతుందని సూచిస్తుంది.
యాంటీబాడీ-ఆధారిత డాట్ బ్లాటింగ్ ఉపయోగించి మేము మా ప్రోటీమిక్స్-ఆధారిత MYH ఫైబర్ టైపింగ్ పద్ధతిని ధృవీకరించాము మరియు రెండు పద్ధతులు స్వచ్ఛమైన టైప్ 1 మరియు టైప్ 2A ఫైబర్‌లను గుర్తించడంలో 100% ఒప్పందాన్ని సాధించాయి (అనుబంధ చిత్రం 2B చూడండి). అయితే, ప్రోటీమిక్స్-ఆధారిత విధానం మరింత సున్నితంగా, మిశ్రమ ఫైబర్‌లను గుర్తించడంలో మరియు ప్రతి ఫైబర్‌లో ప్రతి MYH జన్యువు నిష్పత్తిని లెక్కించడంలో మరింత సమర్థవంతంగా ఉంది. ఈ డేటా అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ రకాలను వర్గీకరించడానికి లక్ష్యం, అత్యంత సున్నితమైన ఓమిక్స్-ఆధారిత విధానాన్ని ఉపయోగించడం యొక్క ప్రభావాన్ని ప్రదర్శిస్తుంది.
తరువాత మేము ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్స్ మరియు ప్రోటీయోమిక్స్ అందించిన మిశ్రమ సమాచారాన్ని ఉపయోగించి మైయోఫైబర్‌లను వాటి పూర్తి ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ లేదా ప్రోటీమ్ ఆధారంగా నిష్పాక్షికంగా వర్గీకరించాము. డైమెన్షియాలిటీని ఆరు ప్రధాన భాగాలకు (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్స్ 3A–B) తగ్గించడానికి యూనిఫాం మానిఫోల్డ్ ఉజ్జాయింపు మరియు ప్రొజెక్షన్ (UMAP) పద్ధతిని ఉపయోగించి, మేము ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ (మూర్తి 1G) మరియు ప్రోటీమ్ (మూర్తి 1H)లో మైయోఫైబర్ వేరియబిలిటీని దృశ్యమానం చేయగలిగాము. ముఖ్యంగా, ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్స్ లేదా ప్రోటీమిక్స్ డేటాసెట్‌లలో పాల్గొనేవారు (అనుబంధ ఫిగర్స్ 3C–D) లేదా పరీక్షా రోజులు (అనుబంధ ఫిగర్ 3E) ద్వారా మైయోఫైబర్‌లను సమూహం చేయలేదు, ఇది అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో సబ్జెక్ట్ లోపల వేరియబిలిటీ సబ్జెక్ట్ మధ్య వేరియబిలిటీ కంటే ఎక్కువగా ఉంటుందని సూచిస్తుంది. UMAP ప్లాట్‌లో, "వేగవంతమైన" మరియు "నెమ్మదిగా" మైయోఫైబర్‌లను సూచించే రెండు విభిన్న క్లస్టర్‌లు ఉద్భవించాయి (మూర్తి 1G–H). MYH7+ (నెమ్మదిగా) మైయోఫైబర్‌లు UMAP1 యొక్క సానుకూల ధ్రువం వద్ద క్లస్టర్ చేయబడ్డాయి, అయితే MYH2+ మరియు MYH1+ (వేగవంతమైన) మైయోఫైబర్‌లు UMAP1 యొక్క ప్రతికూల ధ్రువం వద్ద క్లస్టర్ చేయబడ్డాయి (చిత్రాలు 1I–J). అయితే, MYH వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా ఫాస్ట్-ట్విచ్ ఫైబర్ రకాలు (అంటే, టైప్ 2A, టైప్ 2X, లేదా మిశ్రమ 2A/2X) మధ్య ఎటువంటి తేడాను గుర్తించలేదు, ఇది MYH1 (చిత్రం 1I–J) లేదా ACTN3 లేదా MYLK2 (అనుబంధ గణాంకాలు 4A–B) వ్యక్తీకరణ వంటి ఇతర క్లాసికల్ 2X మైయోఫైబర్ మార్కర్‌లు మొత్తం ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ లేదా ప్రోటీమ్‌ను పరిగణనలోకి తీసుకున్నప్పుడు వేర్వేరు మైయోఫైబర్ రకాల మధ్య తేడాను గుర్తించదని సూచిస్తుంది. అంతేకాకుండా, MYH2 మరియు MYH7తో పోలిస్తే, కొన్ని ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు లేదా ప్రోటీన్‌లు MYH1 (అనుబంధ గణాంకాలు 4C–H)తో సానుకూలంగా సహసంబంధం కలిగి ఉన్నాయి, ఇది MYH1 సమృద్ధి మైయోఫైబర్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్/ప్రోటీమ్‌ను పూర్తిగా ప్రతిబింబించదని సూచిస్తుంది. UMAP స్థాయిలో మూడు MYH ఐసోఫామ్‌ల మిశ్రమ వ్యక్తీకరణను అంచనా వేసినప్పుడు ఇలాంటి తీర్మానాలు వచ్చాయి (అనుబంధ చిత్రాలు. 4I–J). అందువల్ల, MYH క్వాంటిఫికేషన్ ఆధారంగా మాత్రమే ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ స్థాయిలో 2X ఫైబర్‌లను గుర్తించగలిగినప్పటికీ, మొత్తం ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ లేదా ప్రోటీమ్‌ను పరిగణనలోకి తీసుకున్నప్పుడు MYH1+ ఫైబర్‌లు ఇతర ఫాస్ట్ ఫైబర్‌ల నుండి వేరుగా ఉండవు.
MYH కంటే నెమ్మదిగా ఉండే ఫైబర్ వైవిధ్యత యొక్క ప్రారంభ అన్వేషణగా, మేము నాలుగు స్థాపించబడిన నెమ్మదిగా ఉండే ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట ప్రోటీన్‌లను అంచనా వేసాము: TPM3, TNNT1, MYL3, మరియు ATP2A22. నెమ్మదిగా ఉండే ఫైబర్ ఉప రకాలు ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్స్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 5A) మరియు ప్రోటీమిక్స్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 5B) రెండింటిలోనూ MYH7తో పియర్సన్ సహసంబంధాలను అధికం, అయితే పరిపూర్ణంగా లేకపోయినా చూపించాయి. ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్స్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 5C) మరియు ప్రోటీమిక్స్ (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 5D)లోని అన్ని జన్యు/ప్రోటీన్ ఉపరకాల ద్వారా సుమారు 25% మరియు 33% నెమ్మదిగా ఉండే ఫైబర్‌లను స్వచ్ఛమైన నెమ్మదిగా ఉండే ఫైబర్‌లుగా వర్గీకరించలేదు. అందువల్ల, బహుళ జన్యువు/ప్రోటీన్ ఉపరకాల ఆధారంగా నెమ్మదిగా ఉండే ఫైబర్ వర్గీకరణ అదనపు సంక్లిష్టతను పరిచయం చేస్తుంది, ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్టంగా తెలిసిన ప్రోటీన్‌లకు కూడా. ఒకే జన్యువు/ప్రోటీన్ కుటుంబం యొక్క ఐసోఫామ్‌ల ఆధారంగా ఫైబర్ వర్గీకరణ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల యొక్క నిజమైన వైవిధ్యతను తగినంతగా ప్రతిబింబించకపోవచ్చని ఇది సూచిస్తుంది.
మొత్తం ఓమిక్స్ మోడల్ స్థాయిలో మానవ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల యొక్క ఫినోటైపిక్ వైవిధ్యాన్ని మరింత అన్వేషించడానికి, మేము ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ అనాలిసిస్ (PCA) (Figure 2A) ఉపయోగించి డేటా యొక్క నిష్పాక్షికమైన డైమెన్షనల్ తగ్గింపును నిర్వహించాము. UMAP ప్లాట్‌ల మాదిరిగానే, పాల్గొనేవారు లేదా పరీక్షా రోజు PCA స్థాయిలో ఫైబర్ క్లస్టరింగ్‌ను ప్రభావితం చేయలేదు (అనుబంధ గణాంకాలు 6A–C). రెండు డేటాసెట్‌లలో, MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకాన్ని PC2 వివరించింది, ఇది నెమ్మదిగా-ట్విచ్ టైప్ 1 ఫైబర్‌ల క్లస్టర్‌ను మరియు ఫాస్ట్-ట్విచ్ టైప్ 2A, టైప్ 2X మరియు మిశ్రమ 2A/2X ఫైబర్‌లను కలిగి ఉన్న రెండవ క్లస్టర్‌ను చూపించింది (Figure 2A). రెండు డేటాసెట్‌లలో, ఈ రెండు క్లస్టర్‌లు తక్కువ సంఖ్యలో మిశ్రమ రకం 1/2A ఫైబర్‌ల ద్వారా అనుసంధానించబడి ఉన్నాయి. ఊహించినట్లుగా, ప్రధాన PC డ్రైవర్ల యొక్క అధిక ప్రాతినిధ్య విశ్లేషణ PC2 సంకోచం మరియు జీవక్రియ సంతకాల ద్వారా నడపబడుతుందని నిర్ధారించింది (Figure 2B మరియు అనుబంధ గణాంకాలు 6D–E, అనుబంధ డేటాసెట్‌లు 5–6). మొత్తంమీద, MYH- ఆధారిత ఫైబర్ రకం PC2 వెంట నిరంతర వైవిధ్యాన్ని వివరించడానికి సరిపోతుందని కనుగొనబడింది, 2X ఫైబర్స్ అని పిలవబడేవి తప్ప, వేగవంతమైన క్లస్టర్‌లోని ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ అంతటా పంపిణీ చేయబడ్డాయి.
A. MYH ఆధారంగా ఫైబర్ రకం ప్రకారం రంగు వేయబడిన ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ మరియు ప్రోటీమ్ డేటాసెట్‌ల ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ అనాలిసిస్ (PCA) ప్లాట్‌లు. B. PC2 మరియు PC1లో ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ మరియు ప్రోటీన్ డ్రైవర్‌ల ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ విశ్లేషణ. క్లస్టర్‌ప్రొఫైలర్ ప్యాకేజీ మరియు బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సర్దుబాటు చేసిన p-విలువలను ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. C, D. ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్‌లోని ఇంటర్‌సెల్యులార్ అథెషన్ జీన్ ఆన్టాలజీ (GO) పదాల ప్రకారం మరియు ప్రోటీమ్‌లోని కోస్టామీర్ GO పదాల ప్రకారం PCA ప్లాట్‌లు రంగు వేయబడ్డాయి. బాణాలు ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్ మరియు ప్రోటీన్ డ్రైవర్‌లను మరియు వాటి దిశలను సూచిస్తాయి. E, F. యూనిఫాం మానిఫోల్డ్ ఉజ్జాయింపు మరియు ప్రొజెక్షన్ (UMAP) నెమ్మదిగా/వేగవంతమైన ఫైబర్ రకం నుండి స్వతంత్రంగా వ్యక్తీకరణ ప్రవణతలను చూపించే క్లినికల్‌గా సంబంధిత లక్షణాల ప్లాట్‌లను కలిగి ఉంటాయి. G, H. ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్‌లు మరియు ప్రోటీమ్‌లలో PC2 మరియు PC1 డ్రైవర్‌ల మధ్య సహసంబంధాలు.
ఊహించని విధంగా, MYH-ఆధారిత మైయోఫైబర్ రకం రెండవ అత్యధిక స్థాయి వైవిధ్యాన్ని (PC2) మాత్రమే వివరించింది, MYH-ఆధారిత మైయోఫైబర్ రకం (PC1) తో సంబంధం లేని ఇతర జీవసంబంధమైన కారకాలు అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ వైవిధ్యతను నియంత్రించడంలో ముఖ్యమైన పాత్ర పోషిస్తాయని సూచిస్తున్నాయి. PC1లోని అగ్ర డ్రైవర్ల యొక్క అతి ప్రాతినిధ్యం విశ్లేషణలో PC1లోని వైవిధ్యం ప్రధానంగా ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్‌లోని సెల్-సెల్ సంశ్లేషణ మరియు రైబోజోమ్ కంటెంట్ మరియు ప్రోటీమ్‌లోని కోస్టామీర్లు మరియు రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌ల ద్వారా నిర్ణయించబడిందని వెల్లడించింది (మూర్తి 2B మరియు అనుబంధ గణాంకాలు 6D–E, అనుబంధ డేటా సెట్ 7). అస్థిపంజర కండరాలలో, కోస్టామీర్లు Z-డిస్క్‌ను సార్కోలెమ్మాకు అనుసంధానిస్తాయి మరియు శక్తి ప్రసారం మరియు సిగ్నలింగ్‌లో పాల్గొంటాయి. 25 సెల్-సెల్ సంశ్లేషణ (ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్, మూర్తి 2C) మరియు కోస్టామీర్ (ప్రోటీమ్, మూర్తి 2D) లక్షణాలను ఉపయోగించి వ్యాఖ్యానించబడిన PCA ప్లాట్లు PC1లో బలమైన ఎడమ మార్పును వెల్లడించాయి, ఈ లక్షణాలు కొన్ని ఫైబర్‌లలో సమృద్ధిగా ఉన్నాయని సూచిస్తున్నాయి.
UMAP స్థాయిలో మైయోఫైబర్ క్లస్టరింగ్ యొక్క మరింత వివరణాత్మక పరిశీలనలో చాలా లక్షణాలు మైయోఫైబర్ సబ్‌క్లస్టర్-నిర్దిష్టంగా కాకుండా మైయోఫైబర్ రకం-స్వతంత్ర MYH-ఆధారిత వ్యక్తీకరణ ప్రవణతను ప్రదర్శించాయని తేలింది. CHCHD10 (న్యూరోమస్కులర్ వ్యాధి), SLIT3 (కండరాల క్షీణత), CTDNEP1 (కండరాల వ్యాధి) వంటి రోగలక్షణ పరిస్థితులతో సంబంధం ఉన్న అనేక జన్యువులకు (మూర్తి 2E) ఈ కొనసాగింపు గమనించబడింది. న్యూరోలాజికల్ డిజార్డర్స్ (UGDH), ఇన్సులిన్ సిగ్నలింగ్ (PHIP) మరియు ట్రాన్స్క్రిప్షన్ (HIST1H2AB) (మూర్తి 2F)తో సంబంధం ఉన్న ప్రోటీన్‌లతో సహా ప్రోటీమ్ అంతటా కూడా ఈ కొనసాగింపు గమనించబడింది. సమిష్టిగా, ఈ డేటా వివిధ మైయోఫైబర్‌లలో ఫైబర్ రకం-స్వతంత్ర స్లో/ఫాస్ట్ ట్విచ్ వైవిధ్యంలో కొనసాగింపును సూచిస్తుంది.
ఆసక్తికరంగా, PC2 లోని డ్రైవర్ జన్యువులు మంచి ట్రాన్స్క్రిప్ట్-ప్రోటీమ్ సహసంబంధాన్ని చూపించాయి (r = 0.663) (మూర్తి 2G), నెమ్మదిగా మరియు వేగంగా సంకోచించే ఫైబర్ రకాలు, ముఖ్యంగా అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్స్ యొక్క సంకోచ మరియు జీవక్రియ లక్షణాలు ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రకారం నియంత్రించబడతాయని సూచిస్తున్నాయి. అయితే, PC1 లోని డ్రైవర్ జన్యువులు ట్రాన్స్క్రిప్ట్-ప్రోటీమ్ సహసంబంధాన్ని చూపించలేదు (r = -0.027) (మూర్తి 2H), నెమ్మదిగా/వేగంగా సంకోచించే ఫైబర్ రకాలతో సంబంధం లేని వైవిధ్యాలు ఎక్కువగా పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ప్రకారం నియంత్రించబడతాయని సూచిస్తున్నాయి. PC1 లోని వైవిధ్యాలు ప్రధానంగా రైబోసోమల్ జన్యు ఆన్టాలజీ పదాల ద్వారా వివరించబడ్డాయి మరియు ప్రోటీన్ అనువాదంలో చురుకుగా పాల్గొనడం మరియు ప్రభావితం చేయడం ద్వారా రైబోసోమ్‌లు కణంలో కీలకమైన మరియు ప్రత్యేక పాత్ర పోషిస్తాయి కాబట్టి, 31 మేము తరువాత ఈ ఊహించని రైబోసోమల్ వైవిధ్యతను పరిశోధించడానికి బయలుదేరాము.
GOCC పదం "సైటోప్లాస్మిక్ రైబోజోమ్" (మూర్తి 3A) లోని ప్రోటీన్ల సాపేక్ష సమృద్ధి ప్రకారం మేము మొదట ప్రోటీమిక్స్ ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ విశ్లేషణ ప్లాట్‌ను రంగు వేసాము. ఈ పదం PC1 యొక్క సానుకూల వైపున సమృద్ధిగా ఉన్నప్పటికీ, చిన్న ప్రవణతకు దారితీస్తుంది, రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లు PC1 యొక్క రెండు దిశలలో విభజనను నడిపిస్తాయి (మూర్తి 3A). PC1 యొక్క ప్రతికూల వైపున సమృద్ధిగా ఉన్న రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లలో RPL18, RPS18 మరియు RPS13 (మూర్తి 3B) ఉన్నాయి, అయితే RPL31, RPL35 మరియు RPL38 (మూర్తి 3C) PC1 యొక్క సానుకూల వైపున ప్రధాన డ్రైవర్లు. ఆసక్తికరంగా, ఇతర కణజాలాలతో పోలిస్తే RPL38 మరియు RPS13 అస్థిపంజర కండరాలలో ఎక్కువగా వ్యక్తీకరించబడ్డాయి (అనుబంధ మూర్తి 7A). PC1 లోని ఈ విలక్షణమైన రైబోసోమల్ సంతకాలు ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్‌లో గమనించబడలేదు (అనుబంధ మూర్తి 7B), ఇది పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ నియంత్రణను సూచిస్తుంది.
A. ప్రోటీమ్ అంతటా సైటోప్లాస్మిక్ రైబోసోమల్ జీన్ ఆన్టాలజీ (GO) పదాల ప్రకారం రంగు వేయబడిన ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ అనాలిసిస్ (PCA) ప్లాట్. బాణాలు PCA ప్లాట్‌లో ప్రోటీన్-మధ్యవర్తిత్వ వైవిధ్యం యొక్క దిశను సూచిస్తాయి. ఇచ్చిన ప్రోటీన్ కోసం లైన్ పొడవు ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ స్కోర్‌కు అనుగుణంగా ఉంటుంది. B, C. RPS13 మరియు RPL38 కోసం PCA ఫీచర్ ప్లాట్‌లు. D. సైటోప్లాస్మిక్ రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క పర్యవేక్షించబడని క్రమానుగత క్లస్టరింగ్ విశ్లేషణ. E. అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో విభిన్న సమృద్ధితో రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌లను హైలైట్ చేసే 80S రైబోజోమ్ (PDB: 4V6X) యొక్క నిర్మాణ నమూనా. F. mRNA నిష్క్రమణ ఛానల్ దగ్గర స్థానికీకరించబడిన విభిన్న స్టోయికియోమెట్రీతో రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లు.
రైబోసోమల్ వైవిధ్యత మరియు స్పెషలైజేషన్ యొక్క భావనలు గతంలో ప్రతిపాదించబడ్డాయి, దీని ద్వారా విభిన్న రైబోసోమ్ ఉప జనాభా (రైబోసోమల్ వైవిధ్యత) ఉనికి వివిధ కణజాలాలలో ప్రోటీన్ అనువాదాన్ని నేరుగా ప్రభావితం చేస్తుంది32 మరియు కణాలు33 నిర్దిష్ట mRNA ట్రాన్స్క్రిప్ట్ పూల్స్34 (రైబోసోమ్ స్పెషలైజేషన్) యొక్క ఎంపిక అనువాదం ద్వారా. అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో సహ-వ్యక్తీకరించబడిన రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌ల ఉప జనాభాను గుర్తించడానికి, మేము ప్రోటీమ్‌లోని రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క పర్యవేక్షించబడని క్రమానుగత క్లస్టరింగ్ విశ్లేషణను నిర్వహించాము (మూర్తి 3D, అనుబంధ డేటా సెట్ 8). ఊహించినట్లుగా, రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లు MYH ఆధారంగా ఫైబర్ రకం ద్వారా క్లస్టర్ కాలేదు. అయితే, మేము రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క మూడు విభిన్న క్లస్టర్‌లను గుర్తించాము; మొదటి క్లస్టర్ (రైబోసోమల్_క్లస్టర్_1) RPL38తో సహ-నియంత్రించబడింది మరియు అందువల్ల సానుకూల PC1 ప్రొఫైల్‌తో ఫైబర్‌లలో వ్యక్తీకరణ పెరిగింది. రెండవ క్లస్టర్ (రైబోసోమల్_క్లస్టర్_2) RPS13తో సహ-నియంత్రించబడింది మరియు ప్రతికూల PC1 ప్రొఫైల్‌తో ఫైబర్‌లలో ఎలివేట్ చేయబడింది. మూడవ క్లస్టర్ (రైబోసోమల్_క్లస్టర్_3) అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో సమన్వయ అవకలన వ్యక్తీకరణను చూపించదు మరియు దీనిని "కోర్" అస్థిపంజర కండరాల రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌గా పరిగణించవచ్చు. రైబోసోమల్ క్లస్టర్‌లు 1 మరియు 2 రెండూ ప్రత్యామ్నాయ అనువాదాన్ని నియంత్రించడానికి గతంలో చూపబడిన రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌లను కలిగి ఉంటాయి (ఉదా., RPL10A, RPL38, RPS19, మరియు RPS25) మరియు క్రియాత్మకంగా అభివృద్ధిని ప్రభావితం చేస్తాయి (ఉదా., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 PCA ఫలితాలకు అనుగుణంగా, ఫైబర్‌లలో ఈ రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క గమనించిన వైవిధ్య ప్రాతినిధ్యం కూడా కొనసాగింపును చూపించింది (అనుబంధ చిత్రం 7C).
రైబోజోమ్‌లోని వైవిధ్యభరితమైన రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌ల స్థానాన్ని దృశ్యమానం చేయడానికి, మేము మానవ 80S రైబోజోమ్ యొక్క నిర్మాణ నమూనాను ఉపయోగించాము (ప్రోటీన్ డేటా బ్యాంక్: 4V6X) (మూర్తి 3E). వివిధ రైబోసోమల్ క్లస్టర్‌లకు చెందిన రైబోసోమల్ ప్రోటీన్‌లను వేరుచేసిన తర్వాత, వాటి స్థానాలు దగ్గరగా సమలేఖనం చేయబడలేదు, రైబోజోమ్ యొక్క కొన్ని ప్రాంతాలు/భిన్నాలకు సుసంపన్నతను అందించడంలో మా విధానం విఫలమైందని సూచిస్తుంది. అయితే, ఆసక్తికరంగా, క్లస్టర్ 2లోని పెద్ద సబ్యూనిట్ ప్రోటీన్‌ల నిష్పత్తి క్లస్టర్‌లు 1 మరియు 3 కంటే తక్కువగా ఉంది (అనుబంధ చిత్రం 7D). అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో మార్చబడిన స్టోయికియోమెట్రీ ఉన్న ప్రోటీన్‌లు ప్రధానంగా రైబోజోమ్ ఉపరితలంపై (మూర్తి 3E) స్థానీకరించబడిందని, వివిధ mRNA జనాభాలో అంతర్గత రైబోజోమ్ ఎంట్రీ సైట్ (IRES) మూలకాలతో సంకర్షణ చెందే వాటి సామర్థ్యానికి అనుగుణంగా ఉన్నాయని మేము గమనించాము, తద్వారా ఎంపిక చేసిన అనువాదాన్ని సమన్వయం చేస్తాము. 40, 41 ఇంకా, అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో మార్చబడిన స్టోయికియోమెట్రీ ఉన్న అనేక ప్రోటీన్లు mRNA ఎగ్జిట్ టన్నెల్ (మూర్తి 3F) వంటి క్రియాత్మక ప్రాంతాల సమీపంలో ఉన్నాయి, ఇవి అనువాద పొడుగు మరియు నిర్దిష్ట పెప్టైడ్‌ల అరెస్టును ఎంపికగా నియంత్రిస్తాయి. 42 సారాంశంలో, అస్థిపంజర కండరాల రైబోసోమల్ ప్రోటీన్ల స్టోయికియోమెట్రీ వైవిధ్యతను ప్రదర్శిస్తుందని, ఫలితంగా అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల మధ్య తేడాలు ఏర్పడతాయని మా డేటా సూచిస్తుంది.
తరువాత మేము వేగవంతమైన మరియు నెమ్మదిగా సంకోచించే ఫైబర్ సంతకాలను గుర్తించడానికి మరియు వాటి ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ నియంత్రణ యొక్క విధానాలను అన్వేషించడానికి బయలుదేరాము. రెండు డేటాసెట్లలో (చిత్రాలు 1G–H మరియు 4A–B) UMAP నిర్వచించిన వేగవంతమైన మరియు నెమ్మదిగా సంకోచించే ఫైబర్ క్లస్టర్‌లను పోల్చి చూస్తే, ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణలు వరుసగా 1366 మరియు 804 విభిన్నంగా సమృద్ధిగా ఉన్న లక్షణాలను గుర్తించాయి (చిత్రాలు 4A–B, అనుబంధ డేటాసెట్‌లు 9–12). సార్కోమెర్‌లకు సంబంధించిన సంతకాలలో అంచనా వేసిన తేడాలను మేము గమనించాము (ఉదా., ట్రోపోమియోసిన్ మరియు ట్రోపోనిన్), ఉత్తేజిత-సంకోచ కలపడం (SERCA ఐసోఫామ్‌లు) మరియు శక్తి జీవక్రియ (ఉదా., ALDOA మరియు CKB). అంతేకాకుండా, ప్రోటీన్ యుబిక్విటినేషన్‌ను నియంత్రించే ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు ప్రోటీన్లు వేగవంతమైన మరియు నెమ్మదిగా సంకోచించే ఫైబర్‌లలో (ఉదా., USP54, SH3RF2, USP28, మరియు USP48) (చిత్రాలు 4A–B). అంతేకాకుండా, గతంలో లాంబ్ కండరాల ఫైబర్ రకాలు43 లో భేదాత్మకంగా వ్యక్తీకరించబడిన మరియు గుండె కండరాలలో SERCA కార్యకలాపాలను పెంచే సూక్ష్మజీవుల ప్రోటీన్ జన్యువు RP11-451G4.2 (DWORF), నెమ్మదిగా అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో గణనీయంగా నియంత్రించబడింది (మూర్తి 4A). అదేవిధంగా, వ్యక్తిగత ఫైబర్ స్థాయిలో, జీవక్రియ సంబంధిత లాక్టేట్ డీహైడ్రోజినేస్ ఐసోఫామ్‌లు (LDHA మరియు LDHB, మూర్తి 4C మరియు అనుబంధ మూర్తి 8A) 45,46 వంటి తెలిసిన సంతకాలలో అలాగే గతంలో తెలియని ఫైబర్-రకం-నిర్దిష్ట సంతకాలు (IRX3, USP54, USP28, మరియు DPYSL3 వంటివి) (మూర్తి 4C) వంటి వాటిలో గణనీయమైన తేడాలు గమనించబడ్డాయి. ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటీమిక్ డేటాసెట్‌ల మధ్య భేదాత్మకంగా వ్యక్తీకరించబడిన లక్షణాల యొక్క గణనీయమైన అతివ్యాప్తి ఉంది (అనుబంధ మూర్తి 8B), అలాగే సార్కోమెర్ లక్షణాల యొక్క మరింత స్పష్టమైన అవకలన వ్యక్తీకరణ ద్వారా ప్రధానంగా నడిచే మడత మార్పు సహసంబంధం (మూర్తి 8C). ముఖ్యంగా, కొన్ని సంతకాలు (ఉదా. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) ప్రోటీమిక్ స్థాయిలో మాత్రమే బలమైన పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ నియంత్రణను చూపించాయి మరియు నెమ్మదిగా/వేగంగా ట్విచ్ ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌లను కలిగి ఉన్నాయి (అనుబంధ చిత్రం 8C).
A మరియు B అగ్నిపర్వత ప్లాట్లు, గణాంకాలు 1G–H లోని యూనిఫాం మానిఫోల్డ్ ఉజ్జాయింపు మరియు ప్రొజెక్షన్ (UMAP) ప్లాట్ల ద్వారా గుర్తించబడిన నెమ్మదిగా మరియు వేగంగా ఉండే క్లస్టర్‌లను పోల్చాయి. రంగు చుక్కలు FDR < 0.05 వద్ద గణనీయంగా భిన్నంగా ఉండే ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు లేదా ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తాయి మరియు ముదురు చుక్కలు లాగ్ మార్పు > 1 వద్ద గణనీయంగా భిన్నంగా ఉండే ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు లేదా ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తాయి. బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సర్దుబాటు చేసిన p విలువలు (ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్స్) లేదా లిమ్మా లీనియర్ మోడల్ పద్ధతితో అనుభావిక బయేసియన్ విశ్లేషణతో DESeq2 వాల్డ్ పరీక్షను ఉపయోగించి రెండు-మార్గం గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది, ఆ తర్వాత బహుళ పోలికలు (ప్రోటీమిక్స్) కోసం బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సర్దుబాటు చేయబడింది. C నెమ్మదిగా మరియు వేగంగా వ్యక్తీకరించబడిన ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌ల మధ్య ఎంచుకున్న విభిన్నంగా వ్యక్తీకరించబడిన జన్యువులు లేదా ప్రోటీన్‌ల సంతకం ప్లాట్లు. D గణనీయంగా భిన్నంగా వ్యక్తీకరించబడిన ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు మరియు ప్రోటీన్‌ల సుసంపన్న విశ్లేషణ. అతివ్యాప్తి చెందుతున్న విలువలు రెండు డేటాసెట్‌లలో సమృద్ధిగా ఉంటాయి, ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ విలువలు ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్‌లో మాత్రమే సమృద్ధిగా ఉంటాయి మరియు ప్రోటీమ్ విలువలు ప్రోటీమ్‌లో మాత్రమే సమృద్ధిగా ఉంటాయి. బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సర్దుబాటు చేసిన p-విలువలతో క్లస్టర్‌ప్రొఫైలర్ ప్యాకేజీని ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. E. SCENIC-ఉత్పన్నమైన రెగ్యులేటర్ స్పెసిసిటీ స్కోర్‌లు మరియు ఫైబర్ రకాల మధ్య అవకలన mRNA వ్యక్తీకరణ ఆధారంగా SCENIC గుర్తించిన ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాలు. F. నెమ్మదిగా మరియు వేగంగా ఉండే ఫైబర్‌ల మధ్య విభిన్నంగా వ్యక్తీకరించబడిన ఎంచుకున్న ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాల ప్రొఫైలింగ్.
తరువాత మేము విభిన్నంగా ప్రాతినిధ్యం వహించిన జన్యువులు మరియు ప్రోటీన్ల యొక్క అతిగా ప్రాతినిధ్యం వహించే విశ్లేషణను నిర్వహించాము (మూర్తి 4D, అనుబంధ డేటా సెట్ 13). రెండు డేటాసెట్‌ల మధ్య విభిన్నంగా ఉన్న లక్షణాల కోసం పాత్ వే సుసంపన్నం, కొవ్వు ఆమ్లం β-ఆక్సీకరణ మరియు కీటోన్ జీవక్రియ ప్రక్రియలు (నెమ్మదిగా ఫైబర్‌లు), మైయోఫిలమెంట్/కండరాల సంకోచం (వరుసగా వేగవంతమైన మరియు నెమ్మదిగా ఫైబర్‌లు) మరియు కార్బోహైడ్రేట్ క్యాటాబోలిక్ ప్రక్రియలు (వేగవంతమైన ఫైబర్‌లు) వంటి అంచనా వేసిన తేడాలను వెల్లడించింది. గ్లైకోజెన్ జీవక్రియను నియంత్రించే నియంత్రణ మరియు ఉత్ప్రేరక ఫాస్ఫేటేస్ సబ్‌యూనిట్‌లు (PPP3CB, PPP1R3D, మరియు PPP1R3A) వంటి లక్షణాల ద్వారా నడిచే వేగవంతమైన ఫైబర్‌లలో సెరైన్/థ్రెయోనిన్ ప్రోటీన్ ఫాస్ఫేటేస్ కార్యకలాపాలు కూడా పెరిగాయి (47) (అనుబంధ గణాంకాలు 8D–E). వేగవంతమైన ఫైబర్‌లతో సమృద్ధిగా ఉన్న ఇతర మార్గాలలో ప్రోటీమ్‌లోని ప్రాసెసింగ్ (P-) బాడీలు (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8F), పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ రెగ్యులేషన్‌లో సంభావ్యంగా పాల్గొనేవి (48), మరియు ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్‌లోని ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్ యాక్టివిటీ (SREBF1, RXRG, RORA) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8G) ఉన్నాయి. నెమ్మదిగా ఉండే ఫైబర్‌లు ఆక్సిడోరెడక్టేస్ యాక్టివిటీ (BDH1, DCXR, TXN2) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8H), అమైడ్ బైండింగ్ (CPTP, PFDN2, CRYAB) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8I), ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ మ్యాట్రిక్స్ (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8J), మరియు రిసెప్టర్-లిగాండ్ యాక్టివిటీ (FNDC5, SPX, NENF) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 8K)లో సమృద్ధిగా ఉన్నాయి.
నెమ్మదిగా/వేగవంతమైన కండరాల ఫైబర్ రకం లక్షణాలకు అంతర్లీనంగా ఉండే ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ నియంత్రణపై మరింత అంతర్దృష్టిని పొందడానికి, మేము SCENIC49 (సప్లిమెంటరీ డేటా సెట్ 14) ఉపయోగించి ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ ఫ్యాక్టర్ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ విశ్లేషణను నిర్వహించాము. వేగవంతమైన మరియు నెమ్మదిగా ఉండే కండరాల ఫైబర్‌ల మధ్య అనేక ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాలు గణనీయంగా సుసంపన్నం చేయబడ్డాయి (మూర్తి 4E). ఇందులో గతంలో వేగవంతమైన కండరాల ఫైబర్ అభివృద్ధికి అనుసంధానించబడిన MAFA వంటి ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాలు, అలాగే గతంలో కండరాల ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట జన్యు ప్రోగ్రామ్‌లతో సంబంధం లేని అనేక ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాలు ఉన్నాయి. వీటిలో, PITX1, EGR1 మరియు MYF6 వేగవంతమైన కండరాల ఫైబర్‌లలో అత్యంత సుసంపన్నమైన ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాలు (మూర్తి 4E). దీనికి విరుద్ధంగా, నెమ్మదిగా ఉండే కండరాల ఫైబర్‌లలో ZSCAN30 మరియు EPAS1 (HIF2A అని కూడా పిలుస్తారు) అత్యంత సుసంపన్నమైన ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్ కారకాలు (మూర్తి 4E). దీనికి అనుగుణంగా, MAFA వేగవంతమైన కండరాల ఫైబర్‌లకు అనుగుణంగా UMAP ప్రాంతంలో అధిక స్థాయిలలో వ్యక్తీకరించబడింది, అయితే EPAS1 వ్యతిరేక వ్యక్తీకరణ నమూనాను కలిగి ఉంది (మూర్తి 4F).
తెలిసిన ప్రోటీన్-కోడింగ్ జన్యువులతో పాటు, మానవ అభివృద్ధి మరియు వ్యాధి నియంత్రణలో పాల్గొనే అనేక నాన్-కోడింగ్ RNA బయోటైప్‌లు ఉన్నాయి. 51, 52 ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ డేటాసెట్‌లలో, అనేక నాన్-కోడింగ్ RNAలు ఫైబర్ రకం విశిష్టతను ప్రదర్శిస్తాయి (మూర్తి 5A మరియు సప్లిమెంటరీ డేటాసెట్ 15), వీటిలో LINC01405 ఉన్నాయి, ఇది నెమ్మదిగా ఉండే ఫైబర్‌లకు చాలా నిర్దిష్టంగా ఉంటుంది మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ మయోపతి ఉన్న రోగుల నుండి కండరాలలో తగ్గుదల ఉన్నట్లు నివేదించబడింది. 53 దీనికి విరుద్ధంగా, lnc-ERCC5-5 జన్యువు (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 కు అనుగుణంగా ఉండే RP11-255P5.3, వేగవంతమైన ఫైబర్ రకం విశిష్టతను ప్రదర్శిస్తుంది. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) మరియు RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) రెండూ అస్థిపంజర కండరాల విశిష్టతను ప్రదర్శిస్తాయి (అనుబంధ గణాంకాలు 9A–B) మరియు వాటి 1 Mb జన్యు పరిసరాల్లో తెలిసిన సంకోచ జన్యువులను కలిగి ఉండవు, ఇవి పొరుగు సంకోచ జన్యువులను నియంత్రించడం కంటే ఫైబర్ రకాలను నియంత్రించడంలో ప్రత్యేక పాత్ర పోషిస్తాయని సూచిస్తున్నాయి. వరుసగా LINC01405 మరియు RP11-255P5.3 యొక్క నెమ్మదిగా/వేగవంతమైన ఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌లు RNAస్కోప్ (చిత్రాలు 5B–C) ఉపయోగించి నిర్ధారించబడ్డాయి.
ఎ. కోడింగ్ కాని RNA ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు నెమ్మదిగా మరియు వేగంగా సంకోచించే కండరాల ఫైబర్‌లలో గణనీయంగా నియంత్రించబడతాయి. బి. వరుసగా LINC01405 మరియు RP11-255P5.3 యొక్క నెమ్మదిగా మరియు వేగంగా సంకోచించే ఫైబర్ రకం విశిష్టతను చూపించే ప్రతినిధి RNAస్కోప్ చిత్రాలు. స్కేల్ బార్ = 50 μm. C. RNAస్కోప్ ద్వారా నిర్ణయించబడిన మైయోఫైబర్ రకం-నిర్దిష్ట నాన్-కోడింగ్ RNA వ్యక్తీకరణ యొక్క పరిమాణీకరణ (n = స్వతంత్ర వ్యక్తుల నుండి 3 బయాప్సీలు, ప్రతి వ్యక్తిలోని వేగవంతమైన మరియు నెమ్మదిగా ఉండే కండరాల ఫైబర్‌లను పోల్చడం). రెండు-తోక గల విద్యార్థి t-పరీక్షను ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. బాక్స్ ప్లాట్‌లు మధ్యస్థ మరియు మొదటి మరియు మూడవ క్వార్టైల్‌లను చూపుతాయి, మీసాలు కనిష్ట మరియు గరిష్ట విలువలను సూచిస్తాయి. D. డి నోవో మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్ గుర్తింపు వర్క్‌ఫ్లో (BioRender.comతో సృష్టించబడింది). E. సూక్ష్మజీవుల ప్రోటీన్ LINC01405_ORF408:17441:17358 ప్రత్యేకంగా నెమ్మదిగా అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో వ్యక్తీకరించబడుతుంది (స్వతంత్ర పాల్గొనేవారి నుండి n=5 బయాప్సీలు, ప్రతి పాల్గొనేవారిలో వేగవంతమైన మరియు నెమ్మదిగా ఉండే కండరాల ఫైబర్‌లను పోల్చడం). లిమ్ లీనియర్ మోడల్ పద్ధతిని అనుభావిక బేసియన్ విధానంతో కలిపి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది, తరువాత p-విలువ సర్దుబాటుతో బహుళ పోలికల కోసం బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ పద్ధతిని అనుసరించారు. బాక్స్ ప్లాట్‌లు మీసాలు గరిష్ట/కనిష్ట విలువలను సూచిస్తూ మధ్యస్థ, మొదటి మరియు మూడవ క్వార్టైల్‌లను చూపుతాయి.
ఇటీవల, అనేక పుటేటివ్ నాన్-కోడింగ్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లు ట్రాన్స్‌క్రిప్టెడ్ మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్‌లను ఎన్కోడ్ చేస్తాయని అధ్యయనాలు చూపించాయి, వాటిలో కొన్ని కండరాల పనితీరును నియంత్రిస్తాయి. 44, 55 సంభావ్య ఫైబర్ రకం నిర్దిష్టతతో మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్‌లను గుర్తించడానికి, 1000 ఫైబర్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ డేటాసెట్ (మూర్తి 5D)లో కనిపించే నాన్-కోడింగ్ ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ల (n = 305) సీక్వెన్స్‌లను కలిగి ఉన్న కస్టమ్ FASTA ఫైల్‌ను ఉపయోగించి మేము మా 1000 ఫైబర్ ప్రోటీమ్ డేటాసెట్‌ను శోధించాము. మేము 22 వేర్వేరు ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌ల నుండి 197 మైక్రోబియల్ ప్రోటీన్‌లను గుర్తించాము, వాటిలో 71 నెమ్మదిగా మరియు వేగంగా ఉండే అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల మధ్య భేదాత్మకంగా నియంత్రించబడ్డాయి (అనుబంధ మూర్తి 9C మరియు అనుబంధ డేటా సెట్ 16). LINC01405 కోసం, మూడు సూక్ష్మజీవుల ప్రోటీన్ ఉత్పత్తులు గుర్తించబడ్డాయి, వాటిలో ఒకటి దాని ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌కు సమానమైన స్లో ఫైబర్ స్పెసిఫిక్టీని చూపించింది (మూర్తి 5E మరియు అనుబంధ మూర్తి 9D). అందువల్ల, మేము LINC01405 ను నెమ్మదిగా అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లకు ప్రత్యేకమైన సూక్ష్మజీవుల ప్రోటీన్‌ను ఎన్కోడింగ్ చేసే జన్యువుగా గుర్తించాము.
వ్యక్తిగత కండరాల ఫైబర్‌ల యొక్క పెద్ద-స్థాయి ప్రోటీమిక్ క్యారెక్టరైజేషన్ మరియు ఆరోగ్యకరమైన స్థితులలో ఫైబర్ వైవిధ్యత యొక్క గుర్తించబడిన నియంత్రకాల కోసం మేము సమగ్ర వర్క్‌ఫ్లోను అభివృద్ధి చేసాము. నెమలిన్ మయోపతిలు అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ వైవిధ్యతను ఎలా ప్రభావితం చేస్తాయో అర్థం చేసుకోవడానికి మేము ఈ వర్క్‌ఫ్లోను వర్తింపజేసాము. నెమలిన్ మయోపతిలు కండరాల బలహీనతకు కారణమయ్యే వారసత్వంగా వచ్చే కండరాల వ్యాధులు మరియు ప్రభావితమైన పిల్లలలో, శ్వాసకోశ ఇబ్బంది, పార్శ్వగూని మరియు పరిమిత అవయవ చలనశీలతతో సహా అనేక రకాల సమస్యలతో ఉంటాయి. 19,20 సాధారణంగా, నెమలిన్ మయోపతిలలో, ఆక్టిన్ ఆల్ఫా 1 (ACTA1) వంటి జన్యువులలోని వ్యాధికారక వైవిధ్యాలు నెమ్మదిగా-ట్విచ్ ఫైబర్ మైయోఫైబర్ కూర్పు యొక్క ప్రాబల్యానికి కారణమవుతాయి, అయితే ఈ ప్రభావం వైవిధ్యమైనది. ఒక ముఖ్యమైన మినహాయింపు ట్రోపోనిన్ T1 నెమలిన్ మయోపతి (TNNT1), ఇది వేగవంతమైన ఫైబర్‌ల ప్రాబల్యాన్ని కలిగి ఉంటుంది. అందువల్ల, నెమలిన్ మయోపతిలలో గమనించిన అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ డైస్రెగ్యులేషన్‌లో అంతర్లీనంగా ఉన్న వైవిధ్యతను బాగా అర్థం చేసుకోవడం ఈ వ్యాధులు మరియు మైయోఫైబర్ రకం మధ్య సంక్లిష్ట సంబంధాన్ని విప్పుటకు సహాయపడుతుంది.
ఆరోగ్యకరమైన నియంత్రణలతో (సమూహానికి n=3) పోలిస్తే, ACTA1 మరియు TNNT1 జన్యువులలో ఉత్పరివర్తనలు కలిగిన నెమలిన్ మయోపతి రోగుల నుండి వేరుచేయబడిన మైయోఫైబర్‌లు గుర్తించబడిన మైయోఫైబర్ క్షీణత లేదా డిస్ట్రోఫీని చూపించాయి (మూర్తి 6A, అనుబంధ పట్టిక 3). అందుబాటులో ఉన్న పదార్థం యొక్క పరిమిత మొత్తం కారణంగా ఇది ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణకు గణనీయమైన సాంకేతిక సవాళ్లను అందించింది. అయినప్పటికీ, 272 అస్థిపంజర మైయోఫైబర్‌లలో 2485 ప్రోటీన్‌లను మేము గుర్తించగలిగాము. ఫైబర్‌కు కనీసం 1000 క్వాంటిఫైడ్ ప్రోటీన్‌ల కోసం ఫిల్టర్ చేసిన తర్వాత, 250 ఫైబర్‌లను తదుపరి బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ విశ్లేషణకు గురి చేశారు. ఫిల్టర్ చేసిన తర్వాత, ఫైబర్‌కు సగటున 1573 ± 359 ప్రోటీన్‌లను లెక్కించారు (అనుబంధ మూర్తి 10A, అనుబంధ డేటా సెట్‌లు 17–18). ముఖ్యంగా, ఫైబర్ పరిమాణంలో గణనీయమైన తగ్గింపు ఉన్నప్పటికీ, నెమలిన్ మయోపతి రోగి నమూనాల ప్రోటీమ్ లోతు స్వల్పంగా తగ్గింది. అంతేకాకుండా, మా స్వంత FASTA ఫైల్‌లను ఉపయోగించి ఈ డేటాను ప్రాసెస్ చేయడం (కోడింగ్ కాని ట్రాన్స్‌క్రిప్ట్‌లతో సహా) నెమలిన్ మయోపతి రోగుల నుండి అస్థిపంజర మైయోఫైబర్‌లలో ఐదు సూక్ష్మజీవుల ప్రోటీన్‌లను గుర్తించడం మాకు వీలు కల్పించింది (సప్లిమెంటరీ డేటా సెట్ 19). ప్రోటీమ్ యొక్క డైనమిక్ పరిధి గణనీయంగా విస్తృతంగా ఉంది మరియు నియంత్రణ సమూహంలోని మొత్తం ప్రోటీన్లు మునుపటి 1000-ఫైబర్ ప్రోటీమ్ విశ్లేషణ ఫలితాలతో బాగా సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి (అనుబంధ చిత్రం 10B–C).
A. ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలలో (NM) MYH ఆధారంగా ఫైబర్ క్షీణత లేదా డిస్ట్రోఫీ మరియు వివిధ ఫైబర్ రకాల ప్రాబల్యాన్ని చూపించే మైక్రోస్కోపిక్ చిత్రాలు. స్కేల్ బార్ = 100 μm. ACTA1 మరియు TNNT1 రోగులలో మరకల పునరుత్పత్తిని నిర్ధారించడానికి, ప్రాతినిధ్య చిత్రాలను ఎంచుకునే ముందు మూడు రోగి బయాప్సీలను రెండు నుండి మూడు సార్లు (కేసుకు నాలుగు విభాగాలు) మరక చేశారు. B. MYH ఆధారంగా పాల్గొనేవారిలో ఫైబర్ రకం నిష్పత్తులు. C. నెమలిన్ మయోపతిలు మరియు నియంత్రణలు ఉన్న రోగులలో అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌ల యొక్క ప్రధాన భాగం విశ్లేషణ (PCA) ప్లాట్. D. నెమలిన్ మయోపతిలు మరియు నియంత్రణలు ఉన్న రోగుల నుండి అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లు చిత్రం 2లో విశ్లేషించబడిన 1000 ఫైబర్‌ల నుండి నిర్ణయించబడిన PCA ప్లాట్‌పై అంచనా వేయబడ్డాయి. ఉదాహరణకు, ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలు మరియు నియంత్రణలతో పాల్గొనేవారి మధ్య మరియు ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలతో పాల్గొనేవారి మధ్య తేడాలను పోల్చిన అగ్నిపర్వత ప్లాట్లు. రంగు వృత్తాలు π < 0.05 వద్ద గణనీయంగా భిన్నంగా ఉన్న ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తాయి మరియు ముదురు చుక్కలు FDR < 0.05 వద్ద గణనీయంగా భిన్నంగా ఉన్న ప్రోటీన్‌లను సూచిస్తాయి. లిమ్మా లీనియర్ మోడల్ పద్ధతి మరియు అనుభావిక బయేసియన్ పద్ధతులను ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది, తరువాత బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ పద్ధతిని ఉపయోగించి బహుళ పోలికల కోసం p-విలువ సర్దుబాటు చేయబడింది. H. మొత్తం ప్రోటీమ్ అంతటా మరియు టైప్ 1 మరియు 2A ఫైబర్‌లలో గణనీయంగా భిన్నంగా వ్యక్తీకరించబడిన ప్రోటీన్‌ల యొక్క సుసంపన్న విశ్లేషణ. క్లస్టర్‌ప్రొఫైలర్ ప్యాకేజీ మరియు బెంజమిని-హోచ్‌బర్గ్ సర్దుబాటు చేసిన p-విలువలను ఉపయోగించి గణాంక విశ్లేషణ నిర్వహించబడింది. I, J. ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ అనాలిసిస్ (PCA) ప్లాట్‌లు ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ మాతృక మరియు మైటోకాన్డ్రియల్ జీన్ ఆన్టాలజీ (GO) పదాల ద్వారా రంగు వేయబడ్డాయి.
నెమలిన్ మయోపతిలు అస్థిపంజర కండరాలలో MYH- వ్యక్తీకరించే మయోఫైబర్ రకాల నిష్పత్తిని ప్రభావితం చేయగలవు కాబట్టి,19,20 నెమలిన్ మయోపతిలు మరియు నియంత్రణలు ఉన్న రోగులలో MYH- వ్యక్తీకరించే మయోఫైబర్ రకాలను మేము మొదట పరిశీలించాము. 1000 మైయోఫైబర్ అస్సే (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్స్. 10D–E) కోసం గతంలో వివరించిన నిష్పాక్షిక పద్ధతిని ఉపయోగించి మేము మైయోఫైబర్ రకాన్ని నిర్ణయించాము మరియు మళ్ళీ స్వచ్ఛమైన 2X మైయోఫైబర్‌లను గుర్తించడంలో విఫలమయ్యాము (మూర్తి 6B). ACTA1 ఉత్పరివర్తనలు ఉన్న ఇద్దరు రోగులు టైప్ 1 మైయోఫైబర్‌ల నిష్పత్తిని పెంచారు, అయితే TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి ఉన్న ఇద్దరు రోగులు టైప్ 1 మైయోఫైబర్‌ల నిష్పత్తిని తగ్గించారు (మూర్తి 6B). నిజానికి, ACTA1-నెమలిన్ మయోపతిలలో MYH2 మరియు ఫాస్ట్ ట్రోపోనిన్ ఐసోఫామ్‌ల (TNNC2, TNNI2, మరియు TNNT3) వ్యక్తీకరణ తగ్గింది, అయితే TNNT1-నెమలిన్ మయోపతిలలో MYH7 వ్యక్తీకరణ తగ్గింది (అనుబంధ చిత్రం 11A). నెమలిన్ మయోపతిలలో వైవిధ్య మైయోఫైబర్ రకం మార్పిడి యొక్క మునుపటి నివేదికలకు ఇది అనుగుణంగా ఉంది.19,20 మేము ఈ ఫలితాలను ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ ద్వారా నిర్ధారించాము మరియు ACTA1-నెమలిన్ మయోపతి ఉన్న రోగులకు టైప్ 1 మైయోఫైబర్‌ల ప్రాబల్యం ఉందని కనుగొన్నాము, అయితే TNNT1-నెమలిన్ మయోపతి ఉన్న రోగులకు వ్యతిరేక నమూనా ఉంది (మూర్తి 6A).
సింగిల్-ఫైబర్ ప్రోటీమ్ స్థాయిలో, ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి రోగుల నుండి అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లు ఎక్కువ భాగం నియంత్రణ ఫైబర్‌లతో సమూహంగా ఉంటాయి, TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి ఫైబర్‌లు సాధారణంగా తీవ్రంగా ప్రభావితమవుతాయి (మూర్తి 6C). ప్రతి రోగికి సూడో-ఇన్‌ఫ్లేటెడ్ ఫైబర్‌ల ప్రిన్సిపల్ కాంపోనెంట్ అనాలిసిస్ (PCA) ప్లాట్‌లను ప్లాట్ చేస్తున్నప్పుడు ఇది ప్రత్యేకంగా స్పష్టంగా కనిపించింది, TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి రోగులు 2 మరియు 3 నియంత్రణ నమూనాల నుండి చాలా దూరంగా కనిపిస్తారు (అనుబంధ చిత్రం 11B, అనుబంధ డేటా సెట్ 20). మయోపతి రోగుల నుండి ఫైబర్‌లు ఆరోగ్యకరమైన ఫైబర్‌లతో ఎలా పోలుస్తాయో బాగా అర్థం చేసుకోవడానికి, ఆరోగ్యకరమైన వయోజన పాల్గొనేవారి నుండి 1,000 ఫైబర్‌ల ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణ నుండి పొందిన వివరణాత్మక సమాచారాన్ని మేము ఉపయోగించాము. 1000-ఫైబర్ ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణ (మూర్తి 6D) నుండి పొందిన PCA ప్లాట్‌పై మయోపతి డేటాసెట్ (ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి రోగులు మరియు నియంత్రణలు) నుండి ఫైబర్‌లను మేము అంచనా వేసాము. నియంత్రణ ఫైబర్‌లలో PC2 వెంట MYH ఫైబర్ రకాల పంపిణీ 1000-ఫైబర్ ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణ నుండి పొందిన ఫైబర్ పంపిణీకి సమానంగా ఉంది. అయితే, నెమలిన్ మయోపతి రోగులలో చాలా ఫైబర్‌లు వారి స్థానిక MYH ఫైబర్ రకంతో సంబంధం లేకుండా ఆరోగ్యకరమైన ఫాస్ట్-ట్విచ్ ఫైబర్‌లతో అతివ్యాప్తి చెంది PC2 క్రిందికి మారాయి. అందువల్ల, ACTA1 నెమలిన్ మయోపతి ఉన్న రోగులు MYH-ఆధారిత పద్ధతులను ఉపయోగించి లెక్కించినప్పుడు టైప్ 1 ఫైబర్‌ల వైపు మార్పును చూపించినప్పటికీ, ACTA1 నెమలిన్ మయోపతి మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి రెండూ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ ప్రోటీమ్‌ను ఫాస్ట్-ట్విచ్ ఫైబర్‌ల వైపుకు మార్చాయి.
తరువాత మేము ప్రతి రోగి సమూహాన్ని ఆరోగ్యకరమైన నియంత్రణలతో నేరుగా పోల్చాము మరియు ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతిలలో వరుసగా 256 మరియు 552 భేదాత్మకంగా వ్యక్తీకరించబడిన ప్రోటీన్‌లను గుర్తించాము (మూర్తి 6E–G మరియు అనుబంధ చిత్రం 11C, అనుబంధ డేటా సెట్ 21). జన్యు సుసంపన్న విశ్లేషణ మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రోటీన్లలో సమన్వయ తగ్గుదలను వెల్లడించింది (మూర్తి 6H–I, అనుబంధ డేటా సెట్ 22). ఆశ్చర్యకరంగా, ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలైన్ మయోపతిలలో ఫైబర్ రకాల యొక్క అవకలన ప్రాబల్యం ఉన్నప్పటికీ, ఈ తగ్గుదల MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకం నుండి పూర్తిగా స్వతంత్రంగా ఉంది (మూర్తి 6H మరియు అనుబంధ గణాంకాలు 11D–I, అనుబంధ డేటా సెట్ 23). ACTA1 లేదా TNNT1 నెమలైన్ మయోపతిలలో మూడు సూక్ష్మజీవుల ప్రోటీన్లు కూడా నియంత్రించబడ్డాయి. ఈ మైక్రోప్రొటీన్లలో రెండు, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (దీనిని LINC00598 లేదా Lnc-FOXO1 అని కూడా పిలుస్తారు) మరియు ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), టైప్ 1 మైయోఫైబర్‌లలో మాత్రమే అవకలన సమృద్ధిని చూపించాయి. ENSG00000215483_TR14_ORF67 గతంలో సెల్ సైకిల్ నియంత్రణలో పాత్ర పోషిస్తుందని నివేదించబడింది. 56 మరోవైపు, ఆరోగ్యకరమైన నియంత్రణలతో పోలిస్తే ACTA1-నెమలైన్ మయోపతిలో టైప్ 1 మరియు టైప్ 2A మైయోఫైబర్‌లలో ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 కి అనుగుణంగా) పెరిగింది (అనుబంధ చిత్రం 12A, అనుబంధ డేటా సెట్ 24). దీనికి విరుద్ధంగా, రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లు నెమలిన్ మయోపతి ద్వారా ఎక్కువగా ప్రభావితం కాలేదు, అయినప్పటికీ ACTA1 నెమలిన్ మయోపతిలో RPS17 తక్కువగా నియంత్రించబడింది (Fig. 6E).
ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ విశ్లేషణ ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలలో రోగనిరోధక వ్యవస్థ ప్రక్రియల అప్‌రెగ్యులేషన్‌ను కూడా వెల్లడించింది, అయితే TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలో కూడా సెల్ అడెషన్ పెరిగింది (మూర్తి 6H). ఈ ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ కారకాల యొక్క సుసంపన్నత PC1 మరియు PC2 లలో PCA ని ప్రతికూల దిశలో (అంటే, ఎక్కువగా ప్రభావితమైన ఫైబర్‌ల వైపు) మార్చే ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ మాతృక ప్రోటీన్‌ల ద్వారా ప్రతిబింబిస్తుంది (మూర్తి 6J). రెండు రోగి సమూహాలు రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలు మరియు సార్కోలెమ్మల్ మరమ్మత్తు విధానాలలో పాల్గొన్న ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులర్ ప్రోటీన్‌ల యొక్క పెరిగిన వ్యక్తీకరణను చూపించాయి, అవి అనెక్సిన్‌లు (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 మరియు వాటి సంకర్షణ ప్రోటీన్ S100A1159 (అనుబంధ గణాంకాలు 12B–C). ఈ ప్రక్రియ కండరాల డిస్ట్రోఫీలలో మెరుగుపడుతుందని గతంలో నివేదించబడింది60 కానీ, మనకు తెలిసినంతవరకు, ఇంతకు ముందు నెమలిన్ మయోపతిలతో సంబంధం కలిగి లేదు. గాయం తర్వాత సార్కోలెమ్మల్ మరమ్మత్తు కోసం మరియు మైయోఫైబర్‌లతో కొత్తగా ఏర్పడిన మయోసైట్‌ల కలయిక కోసం ఈ పరమాణు యంత్రం యొక్క సాధారణ పనితీరు అవసరం58,61. అందువల్ల, రెండు రోగి సమూహాలలో ఈ ప్రక్రియ యొక్క పెరిగిన కార్యాచరణ మైయోఫైబర్ అస్థిరత వల్ల కలిగే గాయానికి నష్టపరిహార ప్రతిస్పందనను సూచిస్తుంది.
ప్రతి నెమలిన్ మయోపతి యొక్క ప్రభావాలు బాగా సహసంబంధం కలిగి ఉన్నాయి (r = 0.736) మరియు సహేతుకమైన అతివ్యాప్తిని చూపించాయి (అనుబంధ గణాంకాలు 11A–B), ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి ప్రోటీమ్‌పై సారూప్య ప్రభావాలను కలిగి ఉన్నాయని సూచిస్తున్నాయి. అయితే, కొన్ని ప్రోటీన్లు ACTA1 లేదా TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలో మాత్రమే నియంత్రించబడ్డాయి (అనుబంధ గణాంకాలు 11A మరియు C). ప్రోఫైబ్రోటిక్ ప్రోటీన్ MFAP4 TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలో అత్యంత అప్‌రెగ్యులేటెడ్ ప్రోటీన్లలో ఒకటి కానీ ACTA1 నెమలిన్ మయోపతిలో మారలేదు. HOX జన్యు ట్రాన్స్క్రిప్షన్‌ను నియంత్రించడానికి బాధ్యత వహించే PAF1C కాంప్లెక్స్‌లోని ఒక భాగం అయిన SKIC8, TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలో తగ్గించబడింది కానీ ACTA1 నెమలిన్ మయోపతిలో ప్రభావితం కాలేదు (అనుబంధ గణాంకాలు 11A). ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి యొక్క ప్రత్యక్ష పోలిక TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలో మైటోకాన్డ్రియల్ ప్రోటీన్లలో ఎక్కువ తగ్గింపులు మరియు రోగనిరోధక వ్యవస్థ ప్రోటీన్లలో పెరుగుదలను వెల్లడించింది (మూర్తి 6G–H మరియు అనుబంధ గణాంకాలు 11C మరియు 11H–I). ఈ డేటా TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి (మూర్తి 6A) తో పోలిస్తే TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలో గమనించిన ఎక్కువ క్షీణత/డిస్ట్రోఫీకి అనుగుణంగా ఉంటుంది, ఇది TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి వ్యాధి యొక్క మరింత తీవ్రమైన రూపాన్ని సూచిస్తుందని సూచిస్తుంది.
నెమలిన్ మయోపతి యొక్క గమనించిన ప్రభావాలు మొత్తం కండరాల స్థాయిలో కొనసాగుతాయో లేదో అంచనా వేయడానికి, మేము TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి రోగుల యొక్క అదే సమూహం నుండి కండరాల బయాప్సీల యొక్క బల్క్ ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణను నిర్వహించాము మరియు వాటిని నియంత్రణలతో పోల్చాము (సమూహానికి n=3) (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13A, సప్లిమెంటరీ డేటా సెట్ 25). ఊహించినట్లుగా, నియంత్రణలు ప్రధాన భాగాల విశ్లేషణలో దగ్గరి సంబంధం కలిగి ఉన్నాయి, అయితే TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి రోగులు సింగిల్ ఫైబర్ విశ్లేషణలో కనిపించే మాదిరిగానే అధిక ఇంటర్‌శాంపిల్ వైవిధ్యాన్ని ప్రదర్శించారు (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13B). బల్క్ విశ్లేషణ వ్యక్తిగత ఫైబర్‌లను పోల్చడం ద్వారా హైలైట్ చేయబడిన విభిన్నంగా వ్యక్తీకరించబడిన ప్రోటీన్‌లను (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13C, సప్లిమెంటరీ డేటా సెట్ 26) మరియు జీవ ప్రక్రియలను (సప్లిమెంటరీ ఫిగ్. 13D, సప్లిమెంటరీ డేటా సెట్ 27) పునరుత్పత్తి చేసింది, కానీ వివిధ ఫైబర్ రకాల మధ్య తేడాను గుర్తించే సామర్థ్యాన్ని కోల్పోయింది మరియు ఫైబర్‌ల అంతటా వైవిధ్య వ్యాధి ప్రభావాలను లెక్కించడంలో విఫలమైంది.
కలిసి చూస్తే, ఈ డేటా సింగిల్-మైయోఫైబర్ ప్రోటీమిక్స్ ఇమ్యునోబ్లోటింగ్ వంటి లక్ష్య పద్ధతుల ద్వారా గుర్తించలేని క్లినికల్ జీవసంబంధమైన లక్షణాలను విశదీకరించగలదని నిరూపిస్తుంది. అంతేకాకుండా, ఈ డేటా ఫినోటైపిక్ అడాప్టేషన్‌ను వివరించడానికి ఆక్టిన్ ఫైబర్ టైపింగ్ (MYH)ని మాత్రమే ఉపయోగించడం యొక్క పరిమితులను హైలైట్ చేస్తుంది. నిజానికి, ఫైబర్ రకం మార్పిడి ఆక్టిన్ మరియు ట్రోపోనిన్ నెమలిన్ మయోపతిల మధ్య భిన్నంగా ఉన్నప్పటికీ, రెండు నెమలిన్ మయోపతిలు అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ జీవక్రియ నుండి MYH ఫైబర్ టైపింగ్‌ను వేగంగా మరియు తక్కువ ఆక్సీకరణ కండరాల ప్రోటీమ్ వైపు విడదీస్తాయి.
కణజాలాలు వాటి విభిన్న డిమాండ్లను తీర్చడానికి సెల్యులార్ వైవిధ్యత చాలా కీలకం. అస్థిపంజర కండరాలలో, దీనిని తరచుగా వివిధ స్థాయిల శక్తి ఉత్పత్తి మరియు అలసటతో వర్గీకరించబడిన ఫైబర్ రకాలుగా వర్ణిస్తారు. అయితే, ఇది అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ వైవిధ్యంలో ఒక చిన్న భాగాన్ని మాత్రమే వివరిస్తుందని స్పష్టంగా తెలుస్తుంది, ఇది గతంలో అనుకున్నదానికంటే చాలా వేరియబుల్, సంక్లిష్టమైనది మరియు బహుముఖమైనది. సాంకేతిక పురోగతి ఇప్పుడు అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లను నియంత్రించే కారకాలపై వెలుగునిచ్చింది. నిజానికి, టైప్ 2X ఫైబర్‌లు ప్రత్యేకమైన అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ ఉప రకం కాకపోవచ్చు అని మా డేటా సూచిస్తుంది. అంతేకాకుండా, అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ వైవిధ్యత యొక్క ప్రధాన నిర్ణయాధికారులుగా జీవక్రియ ప్రోటీన్లు, రైబోసోమల్ ప్రోటీన్లు మరియు కణ-సంబంధిత ప్రోటీన్‌లను మేము గుర్తించాము. నెమటోడ్ మయోపతి ఉన్న రోగి నమూనాలకు మా ప్రోటీమిక్ వర్క్‌ఫ్లోను వర్తింపజేయడం ద్వారా, MYH-ఆధారిత ఫైబర్ టైపింగ్ అస్థిపంజర కండరాల వైవిధ్యతను పూర్తిగా ప్రతిబింబించదని మేము నిరూపించాము, ముఖ్యంగా వ్యవస్థ చెదిరిపోయినప్పుడు. నిజానికి, MYH-ఆధారిత ఫైబర్ రకంతో సంబంధం లేకుండా, నెమటోడ్ మయోపతి వేగవంతమైన మరియు తక్కువ ఆక్సీకరణ ఫైబర్‌ల వైపు మార్పుకు దారితీస్తుంది.
19వ శతాబ్దం నుండి అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లను వర్గీకరించారు. ఇటీవలి ఓమిక్స్ విశ్లేషణలు వివిధ MYH ఫైబర్ రకాల వ్యక్తీకరణ ప్రొఫైల్‌లను మరియు విభిన్న ఉద్దీపనలకు వాటి ప్రతిస్పందనలను అర్థం చేసుకోవడానికి మాకు అనుమతి ఇచ్చాయి. ఇక్కడ వివరించినట్లుగా, అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ రకాన్ని నిర్వచించడానికి ఒకే (లేదా కొన్ని) మార్కర్ల పరిమాణీకరణపై ఆధారపడకుండా, సాంప్రదాయ యాంటీబాడీ-ఆధారిత పద్ధతుల కంటే ఫైబర్ రకం మార్కర్‌లను లెక్కించడానికి ఓమిక్స్ విధానాలు ఎక్కువ సున్నితత్వాన్ని కలిగి ఉంటాయి. మేము పరిపూరకరమైన ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటీమిక్ వర్క్‌ఫ్లోలను ఉపయోగించాము మరియు మానవ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో ఫైబర్ వైవిధ్యత యొక్క ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ మరియు పోస్ట్-ట్రాన్స్‌క్రిప్షనల్ నియంత్రణను పరిశీలించడానికి ఫలితాలను సమగ్రపరిచాము. ఈ వర్క్‌ఫ్లో ఫలితంగా మా ఆరోగ్యకరమైన యువకుల సమూహం యొక్క వాస్టస్ లాటరాలిస్‌లో ప్రోటీన్ స్థాయిలో స్వచ్ఛమైన 2X-రకం ఫైబర్‌లను గుర్తించడంలో విఫలమైంది. ఇది మునుపటి సింగిల్ ఫైబర్ అధ్యయనాలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది, ఇది ఆరోగ్యకరమైన వాస్టస్ లాటరాలిస్‌లో <1% స్వచ్ఛమైన 2X ఫైబర్‌లను కనుగొన్నప్పటికీ, భవిష్యత్తులో ఇతర కండరాలలో ఇది నిర్ధారించబడాలి. mRNA స్థాయిలో దాదాపు స్వచ్ఛమైన 2X ఫైబర్‌లను గుర్తించడం మరియు ప్రోటీన్ స్థాయిలో మిశ్రమ 2A/2X ఫైబర్‌లను మాత్రమే గుర్తించడం మధ్య వ్యత్యాసం అస్పష్టంగా ఉంది. MYH ఐసోఫార్మ్ mRNA వ్యక్తీకరణ సిర్కాడియన్ కాదు,67 RNA స్థాయిలో స్వచ్ఛమైన 2X ఫైబర్‌లలో మనం MYH2 ప్రారంభ సిగ్నల్‌ను "తప్పిపోయినట్లు" ఉండకపోవచ్చని సూచిస్తుంది. పూర్తిగా ఊహాజనితమైనప్పటికీ, MYH ఐసోఫామ్‌ల మధ్య ప్రోటీన్ మరియు/లేదా mRNA స్థిరత్వంలో తేడాలు ఒక సాధ్యమైన వివరణ కావచ్చు. నిజానికి, ఏ MYH ఐసోఫార్మ్‌కైనా వేగవంతమైన ఫైబర్ 100% స్వచ్ఛమైనది కాదు మరియు 70–90% పరిధిలోని MYH1 mRNA వ్యక్తీకరణ స్థాయిలు ప్రోటీన్ స్థాయిలో MYH1 మరియు MYH2 సమృద్ధికి సమానమైన ఫలితాన్ని ఇస్తాయో లేదో అస్పష్టంగా ఉంది. అయితే, మొత్తం ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమ్ లేదా ప్రోటీమ్‌ను పరిగణనలోకి తీసుకున్నప్పుడు, క్లస్టర్ విశ్లేషణ వాటి ఖచ్చితమైన MYH కూర్పుతో సంబంధం లేకుండా నెమ్మదిగా మరియు వేగవంతమైన అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లను సూచించే రెండు విభిన్న క్లస్టర్‌లను మాత్రమే నమ్మకంగా గుర్తించగలదు. ఇది సింగిల్-న్యూక్లియస్ ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ విధానాలను ఉపయోగించి విశ్లేషణలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది, ఇవి సాధారణంగా రెండు విభిన్న మయోన్యూక్లియర్ క్లస్టర్‌లను మాత్రమే గుర్తిస్తాయి. 68, 69, 70 ఇంకా, మునుపటి ప్రోటీమిక్ అధ్యయనాలు టైప్ 2X ఫైబర్‌లను గుర్తించినప్పటికీ, ఈ ఫైబర్‌లు మిగిలిన ఫాస్ట్ ఫైబర్‌ల నుండి విడిగా క్లస్టర్ చేయవు మరియు MYH ఆధారంగా ఇతర ఫైబర్ రకాలతో పోలిస్తే తక్కువ సంఖ్యలో విభిన్నంగా సమృద్ధిగా ఉన్న ప్రోటీన్‌లను మాత్రమే చూపుతాయి. 14 ఈ ఫలితాలు మనం 20వ శతాబ్దం ప్రారంభంలో కండరాల ఫైబర్ వర్గీకరణ దృక్పథానికి తిరిగి రావాలని సూచిస్తున్నాయి, ఇది మానవ అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లను MYH ఆధారంగా మూడు విభిన్న తరగతులుగా విభజించలేదు, కానీ వాటి జీవక్రియ మరియు సంకోచ లక్షణాల ఆధారంగా రెండు సమూహాలుగా విభజించింది. 63
మరింత ముఖ్యంగా, మైయోఫైబర్ వైవిధ్యతను బహుళ కోణాలలో పరిగణించాలి. మునుపటి "ఓమిక్స్" అధ్యయనాలు ఈ దిశలో సూచించాయి, అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లు వివిక్త సమూహాలను ఏర్పరచవు కానీ నిరంతరాయంగా అమర్చబడి ఉంటాయని సూచిస్తున్నాయి. 11, 13, 14, 64, 71 ఇక్కడ, అస్థిపంజర కండరాల సంకోచ మరియు జీవక్రియ లక్షణాలలో తేడాలతో పాటు, సెల్-సెల్ సంకర్షణలు మరియు అనువాద విధానాలకు సంబంధించిన లక్షణాల ద్వారా మైయోఫైబర్‌లను వేరు చేయవచ్చని మేము చూపిస్తున్నాము. నిజానికి, నెమ్మదిగా మరియు వేగంగా ఉండే ఫైబర్ రకాల నుండి స్వతంత్రంగా వైవిధ్యతకు దోహదపడే అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లలో రైబోజోమ్ వైవిధ్యతను మేము కనుగొన్నాము. నెమ్మదిగా మరియు వేగంగా ఉండే ఫైబర్ రకం నుండి స్వతంత్రంగా ఉండే ఈ గణనీయమైన మైయోఫైబర్ వైవిధ్యతకు అంతర్లీన కారణం అస్పష్టంగానే ఉంది, కానీ ఇది నిర్దిష్ట శక్తులు మరియు లోడ్‌లకు ఉత్తమంగా స్పందించే కండరాల ఫాసికిల్స్‌లోని ప్రత్యేకమైన ప్రాదేశిక సంస్థను సూచించవచ్చు,72 కండరాల సూక్ష్మ వాతావరణంలోని ఇతర కణ రకాలతో ప్రత్యేక సెల్యులార్ లేదా అవయవ-నిర్దిష్ట కమ్యూనికేషన్73,74,75 లేదా వ్యక్తిగత మైయోఫైబర్‌లలోని రైబోజోమ్ కార్యకలాపాలలో తేడాలు73,74,75. నిజానికి, RPL3 మరియు RPL3L యొక్క పారాలోజస్ ప్రత్యామ్నాయం ద్వారా లేదా rRNA యొక్క 2′O-మిథైలేషన్ స్థాయిలో రైబోసోమల్ హెటెరోప్లాస్మీ, అస్థిపంజర కండరాల హైపర్ట్రోఫీతో సంబంధం కలిగి ఉన్నట్లు చూపబడింది76,77. వ్యక్తిగత మైయోఫైబర్‌ల యొక్క క్రియాత్మక లక్షణాలతో కలిపి మల్టీ-ఓమిక్ మరియు స్పేషియల్ అప్లికేషన్‌లు మల్టీ-ఓమిక్ స్థాయిలో కండరాల జీవశాస్త్రంపై మన అవగాహనను మరింత ముందుకు తీసుకువెళతాయి78.
నెమలిన్ మయోపతి ఉన్న రోగుల నుండి సింగిల్ మైయోఫైబర్‌ల ప్రోటీమ్‌లను విశ్లేషించడం ద్వారా, అస్థిపంజర కండరాల క్లినికల్ పాథోఫిజియాలజీని విశదీకరించడానికి సింగిల్ మైయోఫైబర్ ప్రోటీమిక్స్ యొక్క ప్రయోజనం, ప్రభావం మరియు వర్తనీయతను కూడా మేము ప్రదర్శించాము. అంతేకాకుండా, మా వర్క్‌ఫ్లోను గ్లోబల్ ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణతో పోల్చడం ద్వారా, సింగిల్ మైయోఫైబర్ ప్రోటీమిక్స్ గ్లోబల్ టిష్యూ ప్రోటీమిక్స్ వలె అదే లోతు సమాచారాన్ని ఇస్తుందని మరియు ఇంటర్‌ఫైబర్ వైవిధ్యత మరియు మైయోఫైబర్ రకాన్ని లెక్కించడం ద్వారా ఈ లోతును విస్తరిస్తుందని మేము నిరూపించగలిగాము. ఆరోగ్యకరమైన నియంత్రణలతో పోలిస్తే ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలలో గమనించిన ఫైబర్ రకం నిష్పత్తిలో అంచనా వేసిన (వేరియబుల్ అయినప్పటికీ) తేడాలతో పాటు,19 మేము MYH-మధ్యవర్తిత్వ ఫైబర్ రకం మార్పిడి నుండి స్వతంత్రంగా ఆక్సీకరణ మరియు ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ పునర్నిర్మాణాన్ని కూడా గమనించాము. TNNT1 నెమలిన్ మయోపతిలలో ఫైబ్రోసిస్ గతంలో నివేదించబడింది.19 అయితే, ACTA1 మరియు TNNT1 నెమలిన్ మయోపతి ఉన్న రోగుల నుండి మైయోఫైబర్‌లలో, సార్కోలెమ్మల్ రిపేర్ మెకానిజమ్‌లలో పాల్గొన్న అనెక్సిన్‌ల వంటి ఎక్స్‌ట్రాసెల్యులార్ స్రవించే ఒత్తిడి-సంబంధిత ప్రోటీన్‌ల స్థాయిలు పెరిగాయని వెల్లడించడం ద్వారా మా విశ్లేషణ ఈ అన్వేషణపై ఆధారపడుతుంది.57,58,59 ముగింపులో, నెమలిన్ మయోపతి ఉన్న రోగుల నుండి మైయోఫైబర్‌లలో పెరిగిన అనెక్సిన్ స్థాయిలు తీవ్రమైన అట్రోఫిక్ మయోఫైబర్‌లను రిపేర్ చేయడానికి సెల్యులార్ ప్రతిస్పందనను సూచిస్తాయి.
ఈ అధ్యయనం ఇప్పటివరకు మానవుల యొక్క అతిపెద్ద సింగిల్-ఫైబర్ హోల్-మస్కిల్-ఓమిక్స్ విశ్లేషణను సూచిస్తున్నప్పటికీ, దీనికి పరిమితులు లేవు. పాల్గొనేవారి యొక్క సాపేక్షంగా చిన్న మరియు సజాతీయ నమూనా మరియు ఒకే కండరాల (వాస్టస్ లాటరాలిస్) నుండి మేము అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్‌లను వేరుచేసాము. అందువల్ల, కండరాల రకాల్లో మరియు కండరాల శరీరధర్మశాస్త్రం యొక్క తీవ్రతలలో నిర్దిష్ట ఫైబర్ జనాభా ఉనికిని మినహాయించడం అసాధ్యం. ఉదాహరణకు, అధిక శిక్షణ పొందిన స్ప్రింటర్లు మరియు/లేదా బలం అథ్లెట్లలో లేదా కండరాల నిష్క్రియాత్మకత 66,80 కాలంలో అల్ట్రాఫాస్ట్ ఫైబర్‌ల ఉపసమితి (ఉదా., స్వచ్ఛమైన 2X ఫైబర్‌లు) ఉద్భవించే అవకాశాన్ని మేము మినహాయించలేము. ఇంకా, పాల్గొనేవారి పరిమిత నమూనా పరిమాణం ఫైబర్ వైవిధ్యంలో లింగ వ్యత్యాసాలను పరిశోధించకుండా మమ్మల్ని నిరోధించింది, ఎందుకంటే ఫైబర్ రకం నిష్పత్తులు పురుషులు మరియు స్త్రీల మధ్య విభిన్నంగా ఉంటాయి. ఇంకా, మేము ఒకే కండరాల ఫైబర్‌లు లేదా ఒకే పాల్గొనేవారి నమూనాలపై ట్రాన్స్‌క్రిప్టోమిక్ మరియు ప్రోటీమిక్ విశ్లేషణలను నిర్వహించలేకపోయాము. మనం మరియు ఇతరులు అల్ట్రా-తక్కువ నమూనా ఇన్‌పుట్‌ను సాధించడానికి ఓమిక్స్ విశ్లేషణను ఉపయోగించి సింగిల్-సెల్ మరియు సింగిల్-మైయోఫైబర్ విశ్లేషణలను ఆప్టిమైజ్ చేయడం కొనసాగిస్తున్నందున (మైటోకాన్డ్రియల్ మయోపతి ఉన్న రోగుల నుండి ఫైబర్‌ల విశ్లేషణలో ఇక్కడ ప్రదర్శించబడినట్లుగా), ఒకే కండరాల ఫైబర్‌లలో మల్టీ-ఓమిక్స్ (మరియు ఫంక్షనల్) విధానాలను కలపడానికి అవకాశం స్పష్టంగా కనిపిస్తుంది.
మొత్తంమీద, మా డేటా అస్థిపంజర కండరాల వైవిధ్యత యొక్క ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ మరియు పోస్ట్-ట్రాన్స్క్రిప్షనల్ డ్రైవర్లను గుర్తించి వివరిస్తుంది. ప్రత్యేకంగా, ఫైబర్ రకాల యొక్క క్లాసికల్ MYH- ఆధారిత నిర్వచనంతో అనుబంధించబడిన అస్థిపంజర కండరాల శరీరధర్మ శాస్త్రంలో దీర్ఘకాలిక సిద్ధాంతాన్ని సవాలు చేసే డేటాను మేము ప్రस्तుతిస్తాము. మేము చర్చను పునరుద్ధరించాలని మరియు చివరికి అస్థిపంజర కండరాల ఫైబర్ వర్గీకరణ మరియు వైవిధ్యతపై మా అవగాహనను పునరాలోచించాలని ఆశిస్తున్నాము.
పద్నాలుగు మంది కాకేసియన్ పాల్గొనేవారు (12 మంది పురుషులు మరియు 2 మహిళలు) ఈ అధ్యయనంలో పాల్గొనడానికి స్వచ్ఛందంగా అంగీకరించారు. ఈ అధ్యయనాన్ని ఘెంట్ యూనివర్సిటీ హాస్పిటల్ (BC-10237) యొక్క ఎథిక్స్ కమిటీ ఆమోదించింది, 2013 హెల్సింకి డిక్లరేషన్‌కు అనుగుణంగా ఉంది మరియు ClinicalTrials.gov (NCT05131555)లో నమోదు చేయబడింది. పాల్గొనేవారి సాధారణ లక్షణాలు అనుబంధ పట్టిక 1లో ప్రదర్శించబడ్డాయి. మౌఖిక మరియు వ్రాతపూర్వక సమ్మతిని పొందిన తర్వాత, అధ్యయనంలో తుది చేర్చడానికి ముందు పాల్గొనేవారు వైద్య పరీక్ష చేయించుకున్నారు. పాల్గొనేవారు చిన్నవారు (22–42 సంవత్సరాలు), ఆరోగ్యంగా ఉన్నారు (వైద్య పరిస్థితులు లేవు, ధూమపాన చరిత్ర లేదు) మరియు మధ్యస్తంగా శారీరకంగా చురుకుగా ఉన్నారు. గతంలో వివరించిన విధంగా శారీరక దృఢత్వాన్ని అంచనా వేయడానికి స్టెప్ ఎర్గోమీటర్ ఉపయోగించి గరిష్ట ఆక్సిజన్ తీసుకోవడం నిర్ణయించబడింది. 81
కండరాల బయాప్సీ నమూనాలను విశ్రాంతి సమయంలో మరియు ఉపవాస స్థితిలో 14 రోజుల వ్యవధిలో మూడుసార్లు సేకరించారు. ఈ నమూనాలను పెద్ద అధ్యయనంలో భాగంగా సేకరించినందున, పాల్గొనేవారు బయాప్సీకి 40 నిమిషాల ముందు ప్లేసిబో (లాక్టోస్), H1-రిసెప్టర్ విరోధి (540 mg ఫెక్సోఫెనాడిన్), లేదా H2-రిసెప్టర్ విరోధి (40 mg ఫామోటిడిన్) తీసుకున్నారు. ఈ హిస్టామిన్ రిసెప్టర్ విరోధి విశ్రాంతి అస్థిపంజర కండరాల ఫిట్‌నెస్‌ను ప్రభావితం చేయవని మేము గతంలో నిరూపించాము మరియు మా నాణ్యత నియంత్రణ ప్లాట్‌లలో రాష్ట్ర-సంబంధిత క్లస్టరింగ్ గమనించబడలేదు (అనుబంధ గణాంకాలు 3 మరియు 6). ప్రతి ప్రయోగాత్మక రోజుకు 48 గంటల ముందు ప్రామాణిక ఆహారం (41.4 కిలో కేలరీలు/కిలోల శరీర బరువు, 5.1 గ్రా/కిలోల శరీర బరువు కార్బోహైడ్రేట్, 1.4 గ్రా/కిలోల శరీర బరువు ప్రోటీన్ మరియు 1.6 గ్రా/కిలోల శరీర బరువు కొవ్వు) నిర్వహించబడ్డాయి మరియు ప్రయోగాత్మక రోజు ఉదయం ప్రామాణిక అల్పాహారం (1.5 గ్రా/కిలోల శరీర బరువు కార్బోహైడ్రేట్) తీసుకున్నారు. స్థానిక అనస్థీషియా (ఎపినెఫ్రిన్ లేకుండా 0.5 ml 1% లిడోకాయిన్) కింద, పెర్క్యుటేనియస్ బెర్గ్‌స్ట్రోమ్ ఆస్పిరేషన్ ఉపయోగించి వాస్టస్ లాటరాలిస్ కండరాల నుండి కండరాల బయాప్సీలు పొందబడ్డాయి. 82 కండరాల నమూనాలను వెంటనే RNA తరువాత పొందుపరిచారు మరియు మాన్యువల్ ఫైబర్ డిసెక్షన్ (3 రోజుల వరకు) వరకు 4°C వద్ద నిల్వ చేశారు.
తాజాగా వేరుచేయబడిన మైయోఫైబర్ బండిల్స్‌ను కల్చర్ డిష్‌లో తాజా RNA-లేటర్ మీడియంకు బదిలీ చేశారు. స్టీరియోమైక్రోస్కోప్ మరియు ఫైన్ ట్వీజర్‌లను ఉపయోగించి వ్యక్తిగత మైయోఫైబర్‌లను మాన్యువల్‌గా విచ్ఛేదనం చేశారు. ప్రతి బయాప్సీ నుండి ఇరవై ఐదు ఫైబర్‌లను విచ్ఛేదనం చేశారు, బయాప్సీలోని వివిధ ప్రాంతాల నుండి ఫైబర్‌లను ఎంచుకోవడంపై ప్రత్యేక శ్రద్ధ చూపారు. విచ్ఛేదనం తర్వాత, ప్రతి ఫైబర్‌ను అవాంఛిత ప్రోటీన్లు మరియు DNAలను తొలగించడానికి ప్రోటీనేజ్ K మరియు DNase ఎంజైమ్‌లను కలిగి ఉన్న 3 μl లైసిస్ బఫర్ (సింగిల్‌షాట్ సెల్ లైసిస్ కిట్, బయో-రాడ్)లో సున్నితంగా ముంచారు. సెల్ లైసిస్ మరియు ప్రోటీన్/DNA తొలగింపును క్లుప్తంగా వోర్టెక్సింగ్ చేయడం, మైక్రోసెంట్రిఫ్యూజ్‌లో ద్రవాన్ని తిప్పడం మరియు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద (10 నిమిషాలు) ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా ప్రారంభించబడ్డాయి. తరువాత లైసేట్‌ను థర్మల్ సైక్లర్ (T100, బయో-రాడ్)లో 37°C వద్ద 5 నిమిషాలు, 75°C వద్ద 5 నిమిషాలు పొదిగించి, తదుపరి ప్రాసెసింగ్ వరకు వెంటనే -80°C వద్ద నిల్వ చేశారు.
ఇల్యూమినా-అనుకూల పాలిడెనిలేటెడ్ RNA లైబ్రరీలను QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq లైబ్రరీ ప్రిపరేషన్ కిట్ (Lexogen) ఉపయోగించి 2 µl మైయోఫైబర్ లైసేట్ నుండి తయారు చేశారు. తయారీదారు మాన్యువల్‌లో వివరణాత్మక పద్ధతులను చూడవచ్చు. ఈ ప్రక్రియ రివర్స్ ట్రాన్స్క్రిప్షన్ ద్వారా ఫస్ట్-స్ట్రాండ్ cDNA సంశ్లేషణతో ప్రారంభమవుతుంది, ఈ సమయంలో నమూనాల పూలింగ్‌ను నిర్ధారించడానికి మరియు డౌన్‌స్ట్రీమ్ ప్రాసెసింగ్ సమయంలో సాంకేతిక వైవిధ్యాన్ని తగ్గించడానికి ప్రత్యేకమైన మాలిక్యులర్ ఐడెంటిఫైయర్‌లు (UMIలు) మరియు నమూనా-నిర్దిష్ట i1 బార్‌కోడ్‌లు ప్రవేశపెట్టబడతాయి. 96 మైయోఫైబర్‌ల నుండి cDNA తరువాత మాగ్నెటిక్ పూసలతో పూల్ చేయబడి శుద్ధి చేయబడుతుంది, ఆ తర్వాత RNA తొలగించబడుతుంది మరియు యాదృచ్ఛిక ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి రెండవ-స్ట్రాండ్ సంశ్లేషణ జరుగుతుంది. లైబ్రరీని అయస్కాంత పూసలతో శుద్ధి చేస్తారు, పూల్-నిర్దిష్ట i5/i7 ట్యాగ్‌లు జోడించబడతాయి మరియు PCR విస్తరించబడుతుంది. తుది శుద్ధీకరణ దశ ఇల్యూమినా-అనుకూల లైబ్రరీలను ఉత్పత్తి చేస్తుంది. ప్రతి లైబ్రరీ పూల్ యొక్క నాణ్యతను హై సెన్సిటివిటీ స్మాల్ ఫ్రాగ్మెంట్ DNA విశ్లేషణ కిట్ (ఎజిలెంట్ టెక్నాలజీస్, DNF-477-0500) ఉపయోగించి అంచనా వేయబడింది.
క్యూబిట్ క్వాంటిఫికేషన్ ఆధారంగా, ఈక్విమోలార్ సాంద్రతలలో (2 nM) కొలనులను మరింతగా పూల్ చేశారు. ఫలితంగా వచ్చిన కొలనును 2 nM లోడింగ్ (4% PhiX)తో NovaSeq S2 రీజెంట్ కిట్ (1 × 100 న్యూక్లియోటైడ్‌లు) ఉపయోగించి ప్రామాణిక మోడ్‌లో NovaSeq 6000 పరికరంలో క్రమం చేశారు.
మా పైప్‌లైన్ లెక్సోజెన్ యొక్క క్వాంట్‌సెక్ పూల్ డేటా విశ్లేషణ పైప్‌లైన్ (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) పై ఆధారపడి ఉంటుంది. డేటాను మొదట i7/i5 సూచిక ఆధారంగా bcl2fastq2 (v2.20.0) తో డీమల్టిప్లెక్స్ చేశారు. రీడ్ 2 తరువాత i1 నమూనా బార్‌కోడ్ ఆధారంగా ఐడెమక్స్ (v0.1.6) తో డీమల్టిప్లెక్స్ చేయబడింది మరియు UMI సీక్వెన్స్‌లను umi_tools (v1.0.1) తో సంగ్రహించారు. చిన్న రీడ్‌లను (<20 పొడవు) లేదా అడాప్టర్ సీక్వెన్స్‌లను మాత్రమే కలిగి ఉన్న రీడ్‌లను తొలగించడానికి బహుళ రౌండ్లలో కట్‌అడాప్ట్ (v3.4) తో రీడ్‌లను ట్రిమ్ చేశారు. తర్వాత రీడ్‌లను STAR (v2.6.0c) ఉపయోగించి మానవ జన్యువుకు సమలేఖనం చేశారు మరియు BAM ఫైల్‌లను SAMtools (v1.11) తో ఇండెక్స్ చేశారు. umi_tools (v1.0.1) ఉపయోగించి నకిలీ రీడ్‌లు తొలగించబడ్డాయి. చివరగా, సబ్‌రీడ్ (v2.0.3) లోని ఫీచర్‌కౌంట్‌లను ఉపయోగించి అలైన్‌మెంట్ లెక్కింపు నిర్వహించబడింది. పైప్‌లైన్ యొక్క అనేక ఇంటర్మీడియట్ దశలలో FastQC (v0.11.9) ఉపయోగించి నాణ్యత నియంత్రణ నిర్వహించబడింది.
అన్ని తదుపరి బయోఇన్ఫర్మేటిక్స్ ప్రాసెసింగ్ మరియు విజువలైజేషన్ R (v4.2.3)లో నిర్వహించబడ్డాయి, ప్రధానంగా సీరాట్ (v4.4.0) వర్క్‌ఫ్లోను ఉపయోగించి. 83 అందువల్ల, వ్యక్తిగత UMI విలువలు మరియు మెటాడేటా మాత్రికలు సీరాట్ వస్తువులుగా రూపాంతరం చెందాయి. అన్ని ఫైబర్‌లలో 30% కంటే తక్కువ వ్యక్తీకరించబడిన జన్యువులు తొలగించబడ్డాయి. 1000 UMI విలువలు మరియు 1000 గుర్తించబడిన జన్యువుల కనీస పరిమితి ఆధారంగా తక్కువ-నాణ్యత నమూనాలను తొలగించారు. చివరికి, 925 ఫైబర్‌లు అన్ని నాణ్యత నియంత్రణ వడపోత దశలను దాటాయి. సీరాట్ SCTransform v2 పద్ధతిని ఉపయోగించి UMI విలువలు సాధారణీకరించబడ్డాయి, 84 గుర్తించబడిన అన్ని 7418 లక్షణాలను కలిగి ఉన్నాయి మరియు పాల్గొనేవారి మధ్య తేడాలు తిరిగి తొలగించబడ్డాయి. అన్ని సంబంధిత మెటాడేటాను అనుబంధ డేటాసెట్ 28లో కనుగొనవచ్చు.